離子色譜法測定脂肪乳氨基酸葡萄糖注射液中5種離子含量

王濤，馬迅，沈于蘭，申蘭慧

脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液是一種被廣泛應用于重癥醫學科、腫瘤科、外科等科室患者的腸外營養復方制劑［1］，由脂肪乳注射液、復方氨基酸注射液和葡萄糖注射液三腔袋組成；其中復方氨基酸注射液主要為患者提供17種氨基酸與鈉、鉀、鈣、鎂、磷5種人體必需的常量及微量元素［2］。目前，脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液中的磷元素被普遍認為以有機磷（甘油磷酸鈉）的形式存在［3］，現行檢測標準中也只涉及總磷含量的檢測，檢測方法復雜而且未涉及無機磷（游離磷酸鹽）的檢測。但甘油磷酸鈉遇熱會分解產生游離磷酸鹽，而注射液中的游離磷酸鹽易和體內鈣元素反應生成磷酸鈣結晶，引起中心靜脈導管阻塞、肺鈣化等疾病，目前已有多種注射藥品提出對游離磷酸鹽限度進行控制［4-5］。因此，建立一種檢測脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液內游離磷酸鹽的方法十分必要。

離子色譜法作為一種可快速便捷檢測離子型物質的分析手段，具有較高的使用價值［5-6］。

本研究采用IonPac AS18-HC陰離子交換柱和KOH淋洗液梯度洗脫、抑制電導檢測的分離方式，實現了脂肪乳氨基酸葡萄糖注射液內氨基酸注射液的游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子和硫酸根的分離及測定，可同時控制脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液中有機磷及其他無機離子的含量。

1 材料

1.1 藥品與試劑

脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液3批 （批號10NF9063、10NC5276、10NE7472）；α-甘油磷酸根對照品（Sigma公司，批號BCCD2114，純度100.0%）；β-甘油磷酸根對照品（Macklin公司，批號C10844010，純度98.0%）；磷酸二氫鉀（中國食品藥品檢定研究院，批號100745-201804，純度100.0%）；氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號20190307，純度99.5%）；無水硫酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司，批號20180320，純度99.0%）；去離子水由Milli-Q純水系統 制備。

1.2 主要儀器

Thermo ICS-5000+離子色譜系統［包括自動進樣器（ASAP）、泵（DP）、電導檢測器（DC）、Chromeleon7.2色譜工作站，賽默飛世爾科技公司］；XPE205電子分析天平（瑞士Mettler公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；S100H超聲波清洗器（德國ELma公司，500W，50kHz）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用IonPac AS18-HC陰離子交換色譜柱（250mm×4mm，9μm），AG18-HC保 護 柱（50mm×4mm）以不同濃度的KOH水溶液進行梯度洗脫（0~8min，25mmol/L KOH；8~15min，50mmol/L KOH ；15~25min，50mmol/l KOH）；流速：1.0ml/min；進樣量：25μl；檢測方式為抑制電導檢測；檢測器溫度為35℃，柱溫30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液儲備液制備

分別取α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鈉加去離子水溶解制成約含α、β-甘油磷酸根各0.45mg/ml、游離磷酸鹽0.13mg/ml、 氯離子2.3mg/ml、硫酸根0.6mg/ml的對照品溶液。

2.2.2 對照品溶液制備

取“2.2.1”項下對照品溶液儲備液加去離子水稀釋10倍。

2.2.3 供試品溶液制備

精密量取脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液中復方氨基酸注射液1ml置于25ml量瓶，加去離子水稀釋至刻度，搖勻。

2.3 系統適用性及專屬性試驗

取“2.2.2”項下制備的對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進行檢測，色譜圖見圖1。在上述色譜條件下，供試品中的α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、游離磷酸鹽、氯離子、硫酸根之間均能達到基線分離，說明方法專屬性良好。

圖1 系統適用性及專屬性試驗離子色譜圖

2.4 線性范圍考察

精密量取對照品儲備液，逐級稀釋配置一系列標準溶液，按照“2.1”項下色譜條件分別進行檢測。測定游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子、硫酸根峰面積。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。線性關系見表1。

表1 游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子、硫酸根的標準曲線與線性范圍

2.5 檢測限與定量限

取對照品溶液逐級稀釋，進行測定，游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子、硫酸根的檢測限（信噪比為3）和定量限（信噪比為10），見表2。

表2 游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油 磷酸根、氯離子、硫酸根的檢測限和 定量限試驗結果

2.6 精密度試驗

取對照品溶液，按照“2.1”項下色譜條件連續進樣6次（見表3），α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、游離磷酸鹽、氯離子、硫酸根的峰面積相對標準偏差（RSD），結果表明精密度良好。

2.7 重復性試驗

按照“2.2.3”項下方法，利用脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液（批號10ND9063）平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定，α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、游離磷酸鹽、氯離子、硫酸根的峰面積RSD（見表3），結果表明方法重復性良好。

2.8 穩定性試驗

取重復性項下的供試品溶液，分別在0、1、2、4、8和12h進樣計算峰面積，α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、游離磷酸鹽、氯離子、硫酸根的峰面積RSD（見表3），結果表明供試品溶液在12h內穩定。

表3 游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油 磷酸根、氯離子、硫酸根的精密度、 重復性與穩定性 n=6

2.9 回收率試驗

精密量取供試品脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液（批號10NF9063）中復方氨基酸注射液為母液，加去離子水稀釋2.5倍為溶液1。精密量取9份“2.2.1”項下對照品溶液儲備液1ml置于20ml量瓶中，再分別精密量取0.8、1和1.2ml溶液1各3份加入其中，加去離子水稀釋定容搖勻。按照“2.1”項下色譜條件測定，α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、游離磷酸鹽、氯離子以及硫酸根的回收率均值與RSD結果見表4。

表4 游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子、硫酸根的回收率

續表

2.10 樣品測定

取3批脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件測定，3批樣品中游離磷酸鹽含量、α-甘油磷酸根含量、β-甘油磷酸根含量、氯離子含量以及硫酸根含量檢測結果見表5。

表5 3批樣品中游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子、硫酸根含量檢測結果（mmol/L）

2.11 色譜柱的選擇

根據相關文獻［7-8］，對色譜柱IonPac AS11-HC與IonPac AS18-HC分別進行嘗試，結果發現IonPac AS11-HC色譜柱無法對供試品溶液中α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根進行有效的分離，色譜圖見圖2。而通過采用IonPac AS18-HC色譜柱可以使各離子色譜峰完全分離，見圖1。

圖2 IonPac AS11-HC色譜圖

3 討論

游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根、氯離子與硫酸根都具有較高的水合能，在堿性條件下均以陰離子形式存在，因此選用陰離子交換色譜法，以KOH水溶液為淋洗液進行分離。本研究同時比較了多種色譜柱，最終發現IonPac AS18-HC陰離子交換色譜柱對上述5種陰離子的分離效果較好。推測是因AS18柱容量較高，可使用氫氧化物梯度淋洗液以及大體積進樣來測定復雜基體樣品中低濃度級別的無機陰離子，同時其作為氫氧化物選擇性陰離子交換柱，可以快速分離各類常無機陰離子。因此，本研究最終選用IonPac AS18-HC陰離子交換色譜柱。

由表4可知，脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液內復方氨基酸的游離磷酸鹽含量均值為3.55mmol/l。由于本品為三腔袋，給藥前需三腔袋混合，給藥途徑為靜脈注射［9-10］，故在注射入靜脈時游離磷酸鹽含量為0.74mmol/L。而目前2020年版《中國藥典》對甘油磷酸鈉注射液的游離磷酸鹽限度規定為0.03mol/L［4］，甘油磷酸鈉注射液在使用時需按說明書要求進行靜脈給藥，取10ml加入500ml復方氨基酸注射液或葡萄糖注射液中，其通過靜脈給藥實際游離磷酸鹽濃度＜0.6mmol/L。表明3批肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液內甘油磷酸鈉降解產生的游離磷酸鹽均較高，超過了甘油磷酸鈉注射液對游離磷酸鹽的含量限度規定，應引起重視［11-12］。

綜上所述，本研究所開發的離子色譜法無需繁雜的樣品處理方法，操作簡便，可快速、精確、靈敏地測定游離磷酸鹽、α-甘油磷酸根、β-甘油磷酸根濃度，可用于檢測甘油磷酸鈉的降解水平，有助于脂肪乳氨基酸（17）葡萄糖（11%）注射液的投料工藝監測和藥品質量監管。本檢測方法也可同時測定氯離子和硫酸根的濃度，有助于提高藥品檢測效率。