高效液相色譜法同時測定魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量

吳 博，李明瑕，劉姝瑞，劉忠思，黃朝波，陳歷水?

（漯河市衛(wèi)龍生物技術有限公司，漯河市食品安全與營養(yǎng)健康重點實驗室，河南 漯河 462000）

魔芋學名Amorphophallus rerieri，為單子葉植物綱，天南星科耐蔭性多年生草本植物的塊莖[1]。鮮魔芋塊莖經(jīng)過干燥、機械粉碎、風選等工序得到魔芋飛粉、魔芋精粉、魔芋全粉等產(chǎn)物。這些魔芋粉樣品中同時含有葡甘露聚糖（Konjac glucomannan，KGM）和淀粉兩種大分子物質[2]。其中，葡甘露聚糖由D-葡萄糖和 D-甘露糖通過β-1,4糖苷鍵聚合而成[3]。它具有多種獨特的理化性質，如流變性、增稠性、膠凝性和成膜性，同時對人體有降低膽固醇、改善血糖、促進腸道活性和免疫功能的作用[1,4-7]。魔芋淀粉是魔芋第二大營養(yǎng)成分，僅次于KGM，魔芋淀粉也被證明具有調節(jié)消化速率，降低糖尿病患者的血糖反應和胰島素抵抗等功效[1]。

目前，魔芋粉中葡甘露聚糖和淀粉含量的檢測方法通常采用GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》和NYT 494—2010《魔芋粉》描述的方法進行。但是這兩種方法在同時含有葡甘露聚糖和淀粉的魔芋粉樣品的測定中互相干擾，導致測定值均遠高于實際值，不能很好地對魔芋粉樣品進行評價[8-10]。DB 43/T 477—2009《魔芋食品中葡甘聚糖的測定 氣相色譜法》采用氣相色譜法對魔芋精粉中葡甘聚糖含量進行測定，但氣相色譜的衍生過程操作較為繁瑣并且可能產(chǎn)生衍生異構體[11]，同時該方法沒有對魔芋粉中淀粉含量進行分析。

近些年來，柱前衍生化高效液相色譜多被用于多糖物質中單糖組成的測定以及魔芋粉中葡甘聚糖含量的檢測[12-16]。本研究使用柱前衍生高效液相色譜法對四種魔芋粉（魔芋精粉、魔芋飛粉、葡甘露聚糖樣品、魔芋全粉）中葡甘露聚糖和淀粉含量進行分析檢測，同時與上述兩種國家標準方法的測定值進行比較。該實驗結果表明柱前衍生高效液相色譜法能夠對四種不同葡甘聚糖和淀粉占比的魔芋粉樣品進行測定，且該方法回收率高、重復性好，為魔芋粉的質量控制提供理論基礎和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魔芋精粉（樣品1）、魔芋飛粉（樣品2）、葡甘露聚糖樣品（樣品3）、魔芋全粉（樣品4）：楚雄德源魔芋生物科技有限公司；D-甘露糖（純度99%）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮：上海麥克林生化科技有限公司；D-葡萄糖（純度99.5%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；氫氧化鈉、鹽酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜LC-16L：日本島津公司；十萬分之一分析天平：梅特勒公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品中水分、蛋白、灰分、單糖含量的測定

水分測定方法參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中描述的方法進行。蛋白測定方法參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中描述的方法進行。灰分測定方法參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》中描述的方法進行。

單糖含量測定：稱取2.0 g左右魔芋粉樣品，用100 mL乙醇（85%，體積比）數(shù)次洗滌，收集洗滌后的乙醇溶液，水浴蒸干乙醇后，于105 ℃烘箱烘干至恒重，放入干燥器內冷卻0.5 h后稱重。

同時以GB 5009.9—2016 《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》測定淀粉和NYT 494—2010《魔芋粉》中描述的方法測定葡甘露聚糖含量。

1.3.2 樣品前處理

樣品前處理方法參照GB 5009.9—2016《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》中第二法，稍作修改。

除單糖：稱取2.5 g左右魔芋粉樣品（精確到0.001 g），置于放有慢速濾紙的漏斗中，用150 mL乙醇（85%，體積比）分數(shù)次洗滌殘渣，以充分除去可溶性糖類物質。

酸解：濾干乙醇溶液。以100 mL水洗滌漏斗中殘渣并轉移至250 mL錐形瓶中，加入30 mL鹽酸（1+1），接好冷凝管，置沸水浴中回流2 h?；亓魍戤吅?，立即冷卻。

除蛋白、定容：待試樣水解液冷卻后，以氫氧化鈉溶液（400 g/L）調節(jié)樣品pH約為7。然后加20 mL乙酸鉛溶液（200 g/L），搖勻，放置10 min。再加20 mL硫酸鈉溶液（100 g/L），以除去過多的鉛。搖勻后將全部溶液及殘渣轉入500 mL容量瓶中，用水洗滌錐形瓶，洗液合并入容量瓶中，加水稀釋至刻度。過濾，棄去初濾液20 mL，濾液稀釋4倍供測定用。

1.3.3 衍生化方法

衍生化方法參照周彥強等[12]描述的方法進行，稍作修改。取1 mL樣品，加入0.65 mL 0.1 moL/L氫氧化鈉、0.75 mL PMP的甲醇溶液（0.1 g/mL），70 ℃水浴30 min，反應后加入0.65 mL 0.1 moL/L HCL。使用2 mL氯仿洗滌6次。取0.5 mL上清，加入1 mL水，通過0.45 μm水系濾膜過濾，裝入液相小瓶。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：XBridge C18（4.6×150 mm, 5 μm）；流動相：乙腈：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）=18∶72；柱溫30 ℃；檢測波長245 nm，流速0.5 mL/min，進樣量10 μL，檢測時間30 min。

1.3.5 KGM中葡甘露聚糖和淀粉含量的計算方法

標準曲線的制作將混合標準系列工作溶液分別注入液相色譜儀中，測定相應的峰面積，以混合標準系列工作溶液的質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線得到待測液中葡萄糖和甘露糖的質量濃度。

試樣中葡甘露聚糖的含量按式（1）計算，淀粉的含量按式（2）計算：

式中：x1：試樣中的葡甘露聚糖含量（g/100 g）；x2：試樣中的淀粉含量（g/100 g）；ρ1：試樣液中甘露糖的質量濃度（mg/mL）；ρ2：試樣液中葡萄糖的質量濃度（mg/mL）；m：稱樣量（g）；n：樣品稀釋倍數(shù)；1.562：KGM分子中葡甘露聚糖與甘露糖的質量比；0.9：魔芋葡甘露聚糖/淀粉相對分子質量與單糖相對分子質量之比；100：換算系數(shù)；計算結果保留三位有效數(shù)字。

1.3.6 方法學考察

精密度：分別稱取魔芋精粉、魔芋飛粉、市售葡甘露聚糖樣品、魔芋全粉2.5 g各6份，經(jīng)酸解前處理和衍生處理后用高效液相色譜儀分別進行6組基質樣品獨立測試甘露糖和葡萄糖含量，并通過公式計算為葡甘聚糖和淀粉含量，通過計算樣品6組測定值的相對標準偏差評價方法的精密度。

回收率：分別稱取魔芋精粉、魔芋飛粉、市售葡甘露聚糖樣品、魔芋全粉各2.5 g，經(jīng)酸解前處理后進行相應的加標回收實驗，加標后進行衍生并通過高效液相色譜進行測定，每組3個平行。不同樣品的中濃度和高濃度加標量如表1所示。

回收率按公式（3）計算：

在現(xiàn)今高速發(fā)展的信息時代，傳統(tǒng)官僚體制已經(jīng)不能適應現(xiàn)代社會的變革，管理型政府向服務型政府轉變的過程中需要基層政府能夠做出更快的反應、付出更低廉的成本并提供更優(yōu)質的服務，而作為五大資源之一的人力資源的有效開發(fā)與精準運用也就變得尤為重要。

式中：R：回收率；C1：加標后測定濃度（g/L）；C2：加標之前測定濃度（g/L）；C3：加標目標的理論濃度（g/L）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)均以3個以上獨立實驗的平均值和標準差表示。使用SPSS 20.0軟件（IBM，Chicago，IL，USA）進行顯著性分析，P＜0.05表示具有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 樣品中水分、蛋白、灰分、單糖含量

魔芋粉中除葡甘聚糖和淀粉外，還包含蛋白、灰分、單糖、灰分等成分。對四種魔芋粉樣品中蛋白、灰分、單糖、灰分進行測定，能夠更全面的了解不同魔芋粉的組成，測定結果如表2所示。

表2 魔芋粉樣品中水分、灰分、蛋白、單糖含量Table 2 Moisture, ash, protein and monosaccharide contents in konjac flour samples %

2.2 樣品中葡甘聚糖和淀粉含量

在該部分實驗中，分別采用有國標NY/T 494—2010和GB 5009.9—2016第二法以及柱前衍生高效液相色譜法對魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量進行檢測。同時結合魔芋粉中其它理化指標對測定值進行評價，以選擇適于魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量的測定方法。

2.2.1 柱前衍生高效液相色譜法測定樣品中葡甘聚糖和淀粉含量

2.2.1.1 標準曲線的繪制 配置不同濃度的甘露糖和葡萄糖混合溶液，依照1.3中描述的方法對標準品進行衍生和檢測，標準樣品中甘露糖和葡萄糖測定的高效液相色譜圖如圖1所示?？芍?，甘露糖和葡萄糖出峰時間分別為12.883、24.932 min。兩種成分在35 min內達到完全分離，分離度高，峰型好。

圖1 混合標準樣品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standard sample

表3 標準曲線線性參數(shù)Table 3 Linear parameters of standard curves

表4 高效液相色譜法測定樣品中葡甘聚糖和淀粉含量Table 4 Determination of KGM and starch in samples by HPLC %

以標準樣品濃度為橫坐標，峰面積/105為縱坐標繪制標準曲線，線性關系如表3所示。甘露糖和葡萄糖在0.05～1.5 g/L的檢測范圍內，線性相關系數(shù)均大于0.99，線性關系好，可用于單糖樣品的檢測。

2.2.2 標準方法測定樣品中葡甘聚糖和淀粉含量

分別使用GB 5009.9—2016《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》和NYT 494—2010《魔芋粉》中描述的方法測定四種魔芋粉樣品中KGM和淀粉含量，測定結果如表5所示。

表5 標準方法測定樣品中葡甘聚糖和淀粉含量Table 5 Determination of KGM and starch in samples by standard method %

2.2.3 測定結果分析

根據(jù)NY/T 494—2010和GB 5009.9—2016第二法對樣品中葡甘聚糖和淀粉含量進行測定，將測定結果與水分、灰分、蛋白、單糖含量進行累加，其中魔芋精粉總量達185.90%、楚雄德源魔芋飛粉總量達110.00%、葡甘聚糖樣品總量達177.97%、魔芋全粉總量達150.87%，顯然是不合理的。

柱前衍生高效液相色譜法對樣品中葡甘聚糖和淀粉含量進行測定，楚雄德源魔芋精粉總量達97.92%、楚雄德源魔芋飛粉總量達93.25%、襄樊惠葡葡甘露聚糖總量達96.64%、魔芋全粉總量達99.53%，表明該方法能夠很好地用于魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量的檢測。

2.3 方法學考察

2.3.1 方法重復性驗證

根據(jù)上述實驗，完全酸水解結合柱前衍生化的方法能夠很好的用于魔芋粉組成的測定，對該方法測定樣品的重復性進行驗證。4種魔芋粉檢測方法重復性的測定結果如表6所示。

表6 方法重復性驗證（n=6）Table 6 Method repeatability validation (n=6) %

4種魔芋粉樣品中葡甘露聚糖和淀粉6組平行的測定值RSD≤4.40%，表明該方法重復性好，能夠用于魔芋粉中葡甘露聚糖和淀粉含量的測定。

2.3.2 方法回收率驗證

葡甘聚糖為大分子混合物，市面上沒有標準品售賣。故在該實驗中僅測定柱前衍生部分的回收率?；厥章拾尤氲母事短呛推咸烟菢藴势返幕厥章室约罢鬯慊仄细事毒厶呛偷矸鄣幕厥章?。4種魔芋粉檢測方法回收率的測定結果如表7所示。

表7 方法回收率驗證Table 7 Method recovery validation %

4種魔芋粉樣品中甘露糖加標回收率在87.98%～103.31%之間，RSD≤5.25%；葡萄糖加標回收率在92.94%～107.57%之間，RSD≤3.25%；折算回葡甘露聚糖回收率在87.98%～103.31%之間，RSD≤5.25%；淀粉回收率在91.50%～108.05%之間，RSD≤7.67%。回收率測定結果表明該方法回收率高，平行性好。

3 結論

本研究建立了同時檢測4種魔芋粉（魔芋精粉、魔芋飛粉、葡甘露聚糖樣品、魔芋全粉）中葡甘露聚糖和淀粉含量的高效液相色譜方法。魔芋精粉中葡甘露聚糖和淀粉含量分別為62.69%和15.92%；魔芋飛粉中葡甘露聚糖和淀粉含量分別為13.73%和42.16%；葡甘露聚糖樣品中葡甘聚糖和淀粉含量分別71.23%和16.38%；魔芋全粉中葡甘露聚糖和淀粉含量分別為43.32%和24.04%。該方法同時測定4種魔芋粉中葡甘聚糖和淀粉含量6組重復樣品間RSD≤4.40%，加標回收率在87.98%～108.05%之間，RSD≤7.67。本方法可滿足魔芋粉樣品中葡甘聚糖和淀粉含量的同時測定，為魔芋粉樣品的分級提供可行的評價方法。