糙小米發芽過程中游離氨基酸的變化分析

劉敬科，張愛霞，趙 巍，劉瑩瑩，張佳麗，李少輝，王運亭，李朋亮?

（河北省農林科學院 生物技術與食品科學研究所，河北 石家莊 050035）

谷子是我國主要雜糧作物之一，屬耐干旱和耐貧瘠作物，對于緩解農業用水壓力，有效利用旱地、半旱地資源具有極其重要意義[1-2]。谷子去殼后留有胚芽部分和糠層部分為糙小米，糙小米再經精制為小米，小米營養豐富，每100 g小米含碳水化合物63～70 g、粗蛋白約13 g、脂肪2.8～8.0 g[3]，另外還富含多酚和類胡蘿卜素等功能成分[4]。目前谷子以生產小米粥為主要加工方式，加工方式單一嚴重限制著谷子產業的發展。

近年來，發芽技術因其成本低、速度快、無污染的特點，廣泛受到關注[5]。谷物發芽過程中，蛋白質、氨基酸、維生素、黃酮類化合物均會有顯著的提高，對調整谷物營養，提高谷物的功能特性具有重要意義[6]。谷物發芽會導致蛋白質的水解，促進游離氨基酸的升高。鄭藝梅[7]等分析了發芽糙米對蛋白質和氨基酸組成的影響，發現糙米發芽后，易于被消化吸收的谷蛋白增加了，同時游離氨基酸含量也提高了。李欣[8]等對4個品種的糙米進行發芽處理后，必需游離氨基酸組分增加了0.6～15.6倍，充分增加了蛋白質的消化率。另外，發芽還會促進谷物γ-氨基丁酸（GABA）的增加，提高谷物的生理功能活性。

然而，目前對于玉米[5]、大米[7-8]、小麥[9]和大豆[10]等的發芽研究較多，對糙小米發芽的研究較少。發芽糙小米作為一種重要的谷子深加工產品，在發芽過程中可以提高GABA的含量，寧亞維[11]等優化了糙小米的發芽工藝，使GABA含量高達184.75 mg/100g，比未發芽的糙小米提高了8.44倍，遠高于糙米（大米）發芽后GABA的含量（20～90 mg/100g）[12-13]，因此以糙小米為原料進行發芽處理對于富集GABA有積極意義。

溫度和時間是影響谷物發芽的兩個重要因素，進而影響著谷物游離氨基酸的積累，而游離氨基酸對于改善谷物營養價值有重要意義。糙小米顆粒小，發芽速度快，對發芽溫度和時間較為敏感。本研究分析了糙小米在發芽過程中不同溫度和時間對游離氨基酸變化的影響，描述了發芽技術在改善糙小米營養價值和提高糙小米功能特性方面的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用谷子為中谷2號品種，為春夏谷兼播品種，適應性廣，可在華北、西北、東北、新疆播種，米質優良，2019年收割于河北省石家莊市藁城區馬莊實驗站。

次氯酸鈉（有效氯≥10%），分析純：天津市百世化工有限公司；無水氯化鈣，分析純：天津永晟化工有限公司；鹽酸，分析純：天津市大茂化學試劑廠；實驗用水為純水，Heal Force水凈化系統：上海康雷分析儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫培養箱，SPX型：北京科偉永興儀器有限公司；超聲波清洗器，KQ-300DE：昆山市超聲儀器有限公司；全自動氨基酸分析儀，L-8900型：日本日立公司；真空冷凍干燥機，D37520：德國Martin Christ公司；粉碎機，MDJ-D4072型：廣東小熊電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發芽糙小米的制備

糙小米發芽過程中會因脂肪酸氧化而產生不良氣味，前期發現糙小米發芽24 h時氣味較淡，再延長發芽時間，將會使發芽糙小米產生不良氣味，為了考察氨基酸隨發芽時間的變化，在本實驗特意將發芽時間延長至30 h。具體發芽過程如下：500 g谷子經脫殼后留下胚芽形成糙小米。糙小米經純水漂洗，除去懸浮的癟粒和雜質，用10%（v/v）的次氯酸鈉溶液消毒5 min，再用純水洗凈，然后于恒溫培養箱中用0.5%（w/v）的氯化鈣溶液浸泡12 h，浸泡后的糙小米均勻置于鋪有紗布的白瓷托盤中發芽，浸泡溫度和發芽溫度相同，設置為20、25、30、35、40 ℃，每個溫度下的發芽時間為0，6，12，18，24、30 h，每個樣品3次重復。糙小米發芽期間，用蒸餾水噴灑保持濕潤，每個時間段的發芽糙小米經冷凍干燥后，粉碎過100目篩，并于-20 ℃下保存備用。

1.3.2 發芽糙小米游離氨基酸的測定

游離氨基酸的測定根據文獻[14]的報道，并作一定的修改。準確稱取1 g試樣（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶內，加入80 mL的0.02 mol/L鹽酸溶液，振蕩混勻后，超聲處理30 min，再用0.02 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，混勻后吸取2 mL溶液l0 000 r/min離心5 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾供全自動氨基酸分析儀測定。

1.4 數據分析

實驗中總氨基酸為各游離氨基酸組分的加和；利用MultiExperiment Viewer 4.9.0軟件（網絡免費軟件）進行聚類分析，其中化合物的峰面積需要經過標準化處理（auto-scaling，離均差除以標準偏差），距離度量（Distance metric）選擇Pearson相關性；利用SPSS 21.0（美國IBM公司）軟件進行多重比較分析（Duncan test）和Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同發芽溫度和時間對發芽糙小米游離氨基酸的影響

發芽初始階段，不同處理的發芽糙小米氨基酸含量差異不大，在發芽過程中氨基酸含量才有了明顯的變化，說明消毒和浸泡階段對發芽糙小米中氨基酸的積累作用不大。發芽溫度和時間是糙小米發芽的兩個關鍵因素，對發芽糙小米游離氨基酸的變化有著重要影響。圖1a顯示在不同的溫度下（20～40 ℃）隨著發芽時間的增加，游離氨基酸的總量均有明顯的增加，說明發芽能夠促進氨基酸的富集。發芽溫度過高或過低均會影響總游離氨基酸的增加，其中30 ℃下總游離氨基酸增加最多，最高值在第30 h達到(810.7±69.0) mg/100g，約為0 h的8.4倍；溫度在20和25 ℃下，總游離氨基酸增加較為緩慢；35 ℃下總游離氨基酸增加最快，但是在18 h后氨基酸增加開始變緩；40 ℃下反而不利于氨基酸的增加。種子發芽過程中，蛋白酶會水解蛋白質促進游離氨基酸的增加[7,15]，蛋白酶的活性跟溫度有著重要關系，溫度過高或過低均會影響蛋白酶的活性，影響游離氨基酸的積累[16]。

圖1 不同溫度和時間下發芽糙小米總游離氨基酸（a）和總必需游離氨基酸變化（b）Fig.1 Variations of the contents of total free amino acids (a), and total essential amino acids(b) during the germination of the foxtail millet at different temperatures and time

發芽糙小米必需游離氨基酸的總量也有明顯的增加（圖1b），發芽之后的總必需游離氨基酸量約為發芽前的4.1～12.9倍，其中以30 ℃增加最多，為(367.8±30.2) mg/100g，說明發芽能夠調整谷子的營養，提高必需游離氨基酸的含量，這一現象已經在大米發芽中得到了證明[7]。

2.2 發芽過程中不同類型氨基酸含量變化

發芽過程會促進蛋白質的水解，促進游離氨基酸的增加，而游離氨基酸的增加又會提高蛋白質的生物利用率。在發芽過程中，一些功能性氨基酸含量也會提高，從而促進糙小米相關活性的提高。

2.2.1 天冬氨酸族氨基酸的變化規律分析

在檸檬酸循環中，草酰乙酸可以合成天冬氨酸，在天冬氨酸族氨基酸中，天冬氨酸是蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸和賴氨酸的前體物質[17]。天冬氨酸（Asp）屬于非必需氨基酸，具有改善心肌功能，增強肝臟功能和消除疲勞的作用，在30 ℃下發芽糙小米天冬氨酸含量可達到最高，為(14.0±2.0) mg/100g（圖2a）。蘇氨酸（Thr）屬于必需氨基酸，主要為食品添加劑和飼料強化劑，對促進機體生長發育具有積極作用[18]，在30 ℃下發芽可達到(106±1.0) mg/100g，遠高于其它發芽溫度下形成的蘇氨酸含量（圖2b）。蛋氨酸（Met）屬于必需氨基酸，為含硫氨基酸，可用于防治慢性或者急性肝炎，也可用于緩解有機試劑引起的中毒反應，在30 ℃下發芽可達到(28.0±3.0) mg/100g（圖2c）。異亮氨酸（Ile）屬于必需氨基酸，具有增加飲食和抗貧血的功效，并且能夠治療精神障礙，在30 ℃下發芽可達到(32.0±4.0) mg/100g（圖2d）。賴氨酸（Lys）屬于必需氨基酸，并且在谷物中屬于第一限制氨基酸[19]，對于提高人體發育，增強免疫力和提高中樞神經組織功能具有積極作用，隨著發芽溫度的升高其積累量也逐漸增高，40 ℃下發芽可達到(12.0±3.0) mg/100g（圖2e），約為發芽前的2～3倍，但是發芽后的賴氨酸含量依然很低，仍為限制性氨基酸。天冬氨酸在生物合成中是蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸和賴氨酸的前體物質，在糙小米發芽過程中均呈現了增加趨勢，原因可能是蛋白質的水解增加了這幾種氨基酸的含量。

圖2 不同溫度和時間下發芽糙小米天冬氨酸族氨基酸的變化規律Fig.2 Variations of aspartic acid family from brown foxtail millet during different germination time and temperatures

2.2.2 谷氨酸族氨基酸的變化規律分析

在檸檬酸循環中，α-酮戊二酸是谷氨酸的前體物質，谷氨酸又可以合成脯氨酸和精氨酸[20]。谷氨酸（Glu）為非必需氨基酸，且屬于酸性氨基酸，在自然界中普遍存在，具有降低人體血氨、維持和促進腦細胞功能，治療肝功能不足等作用，在30 ℃下積累達到最高，達到(54.0±3.0) mg/100g，為發芽前的5.4倍（圖3a）。脯氨酸（Pro）為環狀的亞氨基酸，屬于非必需氨基酸，具有維持皮膚和結締組織健康的功能，在30 ℃下發芽可達到最高，為(54.0±9.0) mg/100g（圖3b）。精氨酸（Arg）為堿性氨基酸，屬于非必需氨基酸，能夠參與鳥氨酸循環，有降低血氨和促進生殖的功能[21]，在30和35 ℃下發芽，糙小米中精氨酸含量可達到最高，分別為(43.0±4.0)和(41.0±3.0) mg/100g（圖3c）。在生物合成氨基酸中，谷氨酸為脯氨酸和精氨酸的前體物質，在糙小米發芽過程中，這3種氨基酸均有了顯著增加的趨勢。

圖3 不同溫度和時間下發芽糙小米谷氨酸族氨基酸的變化規律Fig.3 Variations of glutamic acid family from brown foxtail millet during different germination time and temperatures

2.2.3 絲氨酸族氨基酸的變化規律分析

在糖酵解過程中，由甘油酸-3-磷酸可以形成絲氨酸，而絲氨酸可以形成甘氨酸[22]。絲氨酸（Ser）屬于非必需氨基酸，是合成生物體內嘌呤、嘧啶、磷脂等的重要前體物質。糙小米在30 ℃下發芽其含量可以達到最高，為(42.0±4.0) mg/100g。甘氨酸為最簡單的氨基酸，可用于治療重癥肌無力，并且常用于食品和飼料的添加劑，在糙小米發芽過程中甘氨酸在30 ℃下達到了(13.0±2.0) mg/100g。

圖4 不同溫度和時間下發芽糙小米絲氨酸族氨基酸的變化規律Fig.4 Variations of serine family from brown foxtail millet during different germination time and temperatures

2.2.4 丙酮酸族氨基酸的變化規律分析

丙酮酸為糖酵解途徑的最終產物，可以合成丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸[23]。丙酮酸族氨基酸包括丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸，其中丙氨酸具有促進葡萄糖代謝，延緩低血糖的功能，在30和35 ℃下發芽，糙小米中丙氨酸含量可達到最高，分別為(120.0±12.0)和(115.0±14.0) mg/100g。纈氨酸和亮氨酸均屬于必需氨基酸，具有促進機體生長和調節血糖的功能，30 ℃下發芽，糙小米中纈氨酸含量可達到最高，達到(51.0±6.0) mg/100g；40 ℃下發芽，糙小米中亮氨酸含量可達到最高，達到(60.0±10.0) mg/100g。

2.2.5 磷酸戊糖途徑中形成的氨基酸的變化規律分析

磷酸戊糖途徑形成的氨基酸主要有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和組氨酸，其中苯丙氨酸和色氨酸屬于必需氨基酸。苯丙氨酸可以轉化形成酪氨酸，而酪氨酸具有形成黑色素和抗抑郁的功能，糙小米在30 ℃下發芽時苯丙氨酸和酪氨酸含量可達到最高，分別為(37.0±3.0)和(37.0±2.0) mg/100g。色氨酸具有防治癩皮病和改善睡眠的功能，在30 ℃下發芽時色氨酸含量可達到最高，為(26.0±2.0) mg/100g。組氨酸屬于半必需氨基酸，能夠產生組胺，具有擴張血管的功能[24]，在30 ℃下發芽時含量可達到最高，為(29.0±2.0) mg/100g。

圖6 不同溫度和時間下發芽糙小米磷酸戊糖途徑形成的氨基酸的變化規律Fig.6 Variations of amino acids in pentose phosphate pathway from brown foxtail millet during different germination time and temperatures

2.2.6 GABA的變化規律分析

糙小米在發芽過程中GABA也會逐漸積累，尤其是在35 ℃增加到最高，可達到(60.1±1.8) mg/100g，遠高于發芽前的(15.7±1.3) mg/100g（圖7）。寧亞維[11]等在糙小米發芽過程中檢測到GABA含量可達184.75 mg/100g，遠高于本實驗中GABA的含量，可能原因是寧亞偉等在檢測GABA時采用的分光光度法，測定的結果容易偏高。Glu是糙小米中的主要氨基酸，不同發芽溫度下的發芽糙小米中含量差異較大，其中在35 ℃含量較低，為(42±3.7) mg/100g（圖3a）。GABA的前體物質為Glu，對發芽30 h過程中Glu和GABA含量的變化進行Pearson相關性分析，相關系數為-0.831，二者呈現顯著負相關（P=0.032），說明糙小米芽過程中GABA的增加可能由Glu形成。GABA是一種非蛋白質氨基酸，具有降血壓、利尿、鎮定等功能[25]，在人腦中Glu在谷氨酸脫羧酶的作用下可轉化生成GABA[26-27]，但是隨著年齡的增加和生活壓力的加大，GABA的積累會逐漸降低，因此從外界獲取GABA尤為必要[28]。經研究，GABA在自發性高血壓大鼠（SHR）中口服的有效最低劑量為0.3～1 mg/kg[29-30]。在本實驗中，發芽糙小米中的GABA含量可達(60.1±1.8) mg/100g，可以作為一種潛在的功能食品被開發和利用。

圖7 不同溫度和時間下發芽糙小米牛磺酸和GABA的變化規律Fig.7 Variations of taurine and γ-aminobutyric acid from brown foxtail millet during different germination time and temperatures

在糙小米發芽過程中，不同種類的氨基酸含量均會提高，其中在30 ℃下，大多數氨基酸含量增加最多。氨基酸的增加一方面促進了蛋白質消化率的提高，另一方面一些功能氨基酸的增加也會提高發芽糙小米的功能特性。

2.3 多元統計分析糙小米發芽過程中氨基酸的變化規律

熱圖分析屬于聚類分析，能夠將具有相同變化規律的化合物或樣品聚類，通過顏色顯示化合物的變化規律。對不同溫度和時間下發芽糙小米游離氨基酸組分進行熱圖分析（圖8），發現21種氨基酸組分隨著發芽時間的增加均呈現增加現象，但是不同溫度下各氨基酸組分的增加速率和增加量不一致。在20 ℃下，大多數氨基酸增加不明顯；30 ℃下直到發芽30 h氨基酸組分才有了明顯的增加；35 ℃下在發芽18 h便有明顯的增加，到30 h氨基酸組分增加到最大；而在35 ℃下，氨基酸從12 h便開始有所增加，然而最終的增加量卻低于30 h；在40 ℃下，大多數氨基酸組分在18 h開始有明顯增加，但是之后的增加速率變緩慢了。不同溫度和時間下發芽糙小米游離氨基酸組分的變化趨勢和總游離氨基酸的變化趨勢較為一致，最終氨基酸的含量受溫度的影響較大。

圖8 不同溫度和時間下發芽糙小米游離氨基酸組分的變化Fig.8 Variations of the contents of free amino acid components during the germination of the foxtail millet at different temperatures and time

主成分分析屬于一種降維分析，能夠將多個變量轉化為少數變量的分析，解決變量太多而不易統計分析的問題，并且也可以觀察到變量在不同樣品中的分布規律。主成分分析發現，5個發芽溫度下的樣品被分成了5組，但是在發芽初期分組并不明顯，隨著發芽時間的增加，分組才越來越明顯（圖9a），并且隨著發芽時間的增加，氨基酸含量也開始增加，并且在30 ℃下發芽氨基酸積累量達到最高（圖9b）。

圖9 不同溫度和時間下發芽糙小米游離氨基酸組分的變化Fig.9 Variations of the contents of free amino acid components during the germination of the foxtail millet at different temperatures and time

發芽糙小米中游離氨基酸的增加，可以調整谷子營養，促進營養成分的吸收，提高糙小米的生物利用率，尤其是功能氨基酸GABA的增加，可賦予發芽糙小米安神、降血壓和改善記憶力的功效。另外游離氨基酸的增加還會賦予發芽糙小米特殊的風味，鮮味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸）、甜味氨基酸（蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、鳥氨酸）和苦味氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、色氨酸）的增加豐富了谷子的滋味，賦予了發芽糙小米微苦回甘的滋味特征。因此，從營養、功能和滋味上來看，發芽糙小米對于谷子產品的進一步開發具有積極意義。

本實驗顯示發芽30 h后游離氨基酸依然有繼續增加的趨勢，然而，隨著發芽時間的延長，發芽糙小米會因脂肪酸敗而產生不良氣味，影響發芽糙小米的品質，因此不宜發芽時間過長。發芽過程中，谷物的維生素、黃酮類化合物、酚酸類成分等也會有顯著的提高，因此糙小米發芽過程中其它成分的提高有待進一步研究。

3 結論

糙小米在不同溫度的發芽過程中，21種氨基酸組分均會有不同程度的增加。溫度過低，游離氨基酸需要較長的發芽時間才會有一定程度的積累，溫度過高，游離氨基酸的積累會受到影響，因此溫度對發芽糙小米游離氨基酸的影響很大。其中，30 ℃下發芽30 h時總游離氨基酸和總必需氨基酸積累到最大，分別達(810.7±69.0)和(367.8±30.2) mg/100g，說明糙小米發芽可以促進游離氨基酸的增加和營養的改善。在所有氨基酸中，丙氨酸和蘇氨酸增加量最高，其中丙氨酸在30和35 ℃下其含量達到(120.0±12.0)和(115.0±14.0) mg/100g，蘇氨酸在30 ℃下達到(106.0±1.0) mg/100g。GABA在35 ℃下發芽的糙小米中積累到最大，達到(60.1±1.8) mg/100g，說明發芽糙小米能改善谷物的營養價值，并可作為一種潛在的功能食品被開發和利用。