燈盞乙素抑制NOX 的表達改善非酒精性脂肪性肝病肝臟纖維化的研究

楊永銳 ，王麗媛 ，李海雯 ，趙智蓉 ，普 瑞 ，吳貴帥 ，李樹德

（1）昆明市第三人民醫院肝病科 云南省傳染性疾病臨床醫學中心，云南 昆明 650041;2）昆明醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系;3）基礎醫學院，云南 昆明 650500）

在大部分慢性肝病的晚期，由于膠原纖維蛋白（collagen fibrin，CF）的過度表達，形成細胞外基質，導致肝臟組織損傷后修復障礙引起肝臟的纖維化發生[1-2]。早期的肝臟纖維化是一個可逆的病理過程，隨著進一步的進展，會增加患者的死亡率[3]。在纖維化發生和發展的過程中，由氧化應激誘導的肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）和異常炎癥級聯反應的激活是肝纖維化的中心驅動因素[4]。氧化應激的發生是由于抗氧化能力和活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生之間的不平衡導致，由還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NOX）產生的ROS 在氧化應激中占據主導地位。在哺乳動物中NOX 的亞型有NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5 和DUOX1-2。在肝臟中，NOX 以吞噬形式和非吞噬形式進行功能性表達，近年來的研究表明，吞噬NOX2 和非吞噬NOX 亞型，包括NOX1 和NOX4，都介導HSC中不同的促成纖維作用[5]。然而，通過NOX2 和NOX4 介導的ROS 產生在NAFLD 誘導肝臟纖維化的調控機制有待深入研究。

燈盞乙素（scutellarin，SCU）是從菊科短葶飛蓬植物燈盞花中提取出來的生物活性黃酮類化合物，在云南省分布占全球的95%以上[6]。SCU 具有多種藥理特性，包括抗炎、抗氧化、減少心肌缺血大鼠的梗死面積、減輕心肌纖維化和功能障礙、抑制心肌肥厚，防止阿霉素誘導的急性心臟毒性等。在臨床上，SCU 主要被運用于腦卒中和心肌梗死治療[7]。既往研究表明，在豬血清誘導的大鼠肝臟纖維化中，SCU 可以通過抑制HSC 的活化，調節ECM 的合成和降解而起到抗纖維化的作用[6]。在高脂喂養的雄性C57BL/6 小鼠以及在油酸誘導脂質積累的HepG2 細胞中發現SCU 能通過PPARc/PGC-1a-Nrf2 信號通路增強抗氧化劑的水平，減少脂質過氧化作用從而起到保護肝臟的作用[8]。然而，SCU 是否能在肝臟纖維化中通過抑制NOX 的生成起調節氧化應激的作用尚不清楚。因此，在本研究中，通過高脂高糖飲食喂養SD 大鼠建立NAFLD 動物模型，依據課題組前期實驗結果[9]建立SCU 低、中、高劑量治療組，探討SCU 能否在NAFLD 動物模型中降低氧化應激相關蛋白NOX2 和NOX4 的表達，減少ROS 的生成，抑制氧化應激，從而改善肝臟的纖維化程度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物體重為180～220 g 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠由昆明醫科大學實驗動物學部提供，動物合格證編號：SCXK（滇）K2020-0004，SPF 級。實驗動物的飼養條件為：恒溫（22±2）℃，恒濕（55±5）%，晝夜明暗交替時間12/12h。本研究通過大理大學倫理委員會審核。

1.1.2 主要試劑燈盞乙素（云南植物藥業有限公司）；大鼠ROS 檢測試劑盒（鈺博生物）；NOX2、NOX4 一抗（Affinity Bioscience）；二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；PVDF 膜（Millipore Corporation）；ECL 化學發光底物試劑盒（Biosharp）等。

1.1.3 主要設備半干轉膜儀221BR 51253（美國BIO-RAD 公司）；冰凍切片機CM1950（德國徠卡相機股份有限公司）；直流電泳儀（北京六一儀器廠）；全波段酶標儀（Thermo Fisher Scientific）；石蠟包埋機（Leica Biosystems）等。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組將180～220 g 的雄性SD大鼠60 只，適應性喂養2 周后隨機分為6 組，每組10 只，分別為正常組、模型組、SCU 低劑量治療組、SCU 中劑量治療組、SCU 高劑量治療組、姜黃素陽性藥物治療組。

1.2.2 實驗動物造模除了正常組給予正常飼料24 周外，其余各實驗組給予高脂高糖飲食喂養24 周。

1.2.3 SCU 灌胃治療及取材造模24 周后，SCU低、中、高劑量治療組分別采用25 mg/（kg·d）、50 mg/（kg·d）、100 mg/（kg·d）的SCU 灌胃治療，姜黃素陽性藥物治療組采用200 mg/（kg·d）的姜黃素灌胃治療；治療期間，模型對照組，SCU 低、中、高劑量治療組以及姜黃素陽性藥物治療組繼續給予高脂高糖飲食喂養。8 周后，大鼠禁食8～12 h，1%戊巴比妥鈉麻醉狀態下取血，4 000 r/min，離心5 min 獲得血清；取部分肝臟組織及4%多聚甲醛固定24 h，流水沖洗3 h，進行梯度酒精脫水、二甲苯透明和石蠟包埋，用于形態學和免疫組織化學檢測。部分肝臟組織液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.4 大鼠體重、肝重和肝臟指數的測定灌胃治療8 周后，稱取各組大鼠體重。麻醉狀態下，稱取各組大鼠肝重，并計算肝臟指數。肝臟指數（%）=肝臟重量（g）/體重（g）×100%[10]。

1.2.5 血清ROS 測定取各組大鼠的血清，嚴格按照說明書步驟進行。通過酶標儀檢測各組血清的OD 值，按照說明書要求計算出血清中ROS的含量。

1.2.6 肝臟組織ROS 的測定稱取一定量的新鮮大鼠肝臟組織于預先加入預冷PBS 的EP 管中置于超聲破碎儀中，制備成10%的組織勻漿，嚴格按照說明書進行操作，檢測其OD 值，根據標曲公式計算出組織中ROS 的含量。

1.2.7 肝臟組織油紅“O”染色10 μm 的冰凍切片置于常溫中平衡30 min 后，用甲醛鈣固定液固定10 min，油紅“O”染液染色10 min，60%異丙醇分化，流水終止分化，蘇木素復染核3 min，自來水返藍，甘油明膠封片，在光學顯微鏡在觀察分析。

1.2.8 肝臟組織Masson 染色石蠟包埋的肝臟組織制備4 μm 的組織切片，常規脫蠟至水。切片入Bouin 液于60 ℃恒溫溫箱媒染2 h，然后流水沖洗至切片上的黃色消失，天青石藍滴染3 min，Mayer 蘇木素滴染3 min，酸性乙醇分化液稍分化后流水沖洗10 min，麗春紅品紅滴染10 min，磷鉬酸處理10 min，傾去上液直接滴加苯胺藍染5 min，最后弱酸處理2 min 后進行95%乙醇快速脫水，無水乙醇脫水以及二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察分析。

1.2.9 Western blot 檢測肝臟組織中的NOX2、NOX4 的表達稱20～30 mg 的大鼠肝臟組織于1.5 mL 的EP 管中，每管加入RIPA 組織裂解液300 μL 與PMSF 3 μL，混勻，置于超聲細胞破碎儀中進行破碎，12 000 r/min，離心10 min，取上清液。BCA 法測定蛋白濃度。每組取40 μg 蛋白進行SDS-PAGE 電泳，電泳結束后，根據所需目的因子分子量進行切膠，半干轉移法轉至PVDF膜上，轉膜結束后置于5%的脫脂奶粉中在37 ℃恒溫搖床中封閉1 h，后分別加入NOX2、NOX4（1∶1 000）一抗于4 ℃冰箱孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入相應的二抗結合一抗，常溫孵育2 h。洗膜后顯影并Image J 進行灰度值分析。

1.2.10 肝臟組織免疫組織化學染色石蠟切片經1%檸檬酸鈉抗原修復液修復后，用3%的H2O2孵育30 min，抗原提取后，用5%牛血清孵育30 min。最后滴加NOX2、NOX4（1∶200）一抗在4℃冰箱孵育過夜，PBS 洗滌3 次后滴加即用型免疫組化二抗，常溫孵育30 min，PBS 洗滌3次后滴加新鮮配制的DAB 顯色3～5 min 后用PBS 沖洗終止顯色；蘇木素復染2 min，鹽酸酒精分化10 s 后用流水8 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，在光學顯微鏡觀察及分析。

1.3 統計學處理

采用SPSS 統計學軟件進行分析；大鼠體重、肝重及肝臟指數用均數±標準差（±s）表示，2組間的比較使用配對t檢驗，P＜ 0.05 表示差異具有統計學意義。應用GraphPad Prism6.0 進行圖表制作。

2 結果

2.1 各組大鼠體重、肝重及肝臟指數的變化

與正常組相比，模型組大鼠體重、肝重及肝臟指數增加明顯（P＜ 0.01）；與模型組相比，SCU各治療組大鼠體重，肝重及肝臟指數下降，且SCU-100 高劑量治療組大鼠的體重，肝重下降明顯（P＜ 0.01），陽性藥物治療組大鼠體重、肝重及肝臟指數下降明顯（P＜ 0.01）。結果顯示，在高脂高糖飲食誘導的NAFLD 中，大鼠的體重、肝重及肝臟指數均增加，SCU 治療可以降低大鼠體重、肝重以及肝臟指數，見表1。

表1 大鼠體重、肝重及肝臟指數（±s）Tab.1 Body weight，liver weight and liver index of rats （±s）

表1 大鼠體重、肝重及肝臟指數（±s）Tab.1 Body weight，liver weight and liver index of rats （±s）

與正常組比較，## P ＜ 0.01，與模型組比較，*P ＜ 0.01，**P ＜ 0.01。

2.2 血清ROS 濃度

與正常組相比，模型組血清ROS 濃度增加明顯（P＜ 0.01）；與模型組相比，SCU 低治療組血清ROS 濃度降低（P＜ 0.05），SCU 中、高治療組血清ROS 濃度降低明顯（P＜ 0.01），陽性藥物治療組血清ROS 濃度降低（P＜ 0.05）。結果表明，在高脂高糖飲食誘導的NAFLD 中，血清ROS 濃度增加，SCU 治療可以降低血清ROS 濃度，見圖1。

圖1 血清中ROS 的濃度Fig.1 Concentration of ROS in the serum

2.3 肝臟組織ROS 濃度

與正常組相比，模型組肝臟組織ROS 濃度增加明顯（P＜ 0.01）；與模型組相比，SCU 各治療組和陽性藥物治療組的肝臟組織ROS 濃度降低明顯（P＜ 0.01）。結果表明，在高脂高糖飲食誘導的NAFLD 中，肝臟組織ROS 濃度增加，SCU 治療可以降低肝臟組織ROS 濃度，見圖2。

圖2 肝臟組織中ROS 的濃度Fig.2 Concentration of ROS in the liver tissues

2.4 肝臟組織油紅“O”染色

正常組大鼠肝臟組織僅有極少量脂質沉積（圖3A）；模型組大鼠肝臟組織中脂質沉積增加（圖3B）；SCU 各治療組大鼠肝臟組織中脂質沉積現象逐漸減少（圖3C、D、E）；陽性藥物對照組大鼠肝臟組織中脂質沉積也減少（圖3F）。結果表明，SCU 可以減少NAFLD 肝臟組織的脂質沉積。

圖3 肝臟組織油紅“O”染色（×400）Fig.3 Oil red "O" staining of liver tissue（×400）

2.5 肝臟組織Masson 染色

正常組匯管區僅有少量膠原纖維沉積（圖4A）；模型組匯管區有大量藍色膠原纖維沉積且開始向肝細胞延伸（圖4B）；與模型組相比，SCU 各治療組匯管區膠原纖維開始減少，肝臟纖維化的程度有所減輕（圖4C、D、E）；陽性藥物治療組匯管區纖維化程度較輕（圖4F）。

圖4 肝臟組織Masson 染色（×400）Fig.4 Masson staining of liver tissue（×400）

2.6 NOX2、NOX4 蛋白質的表達

Western blot 結果顯示：與正常組相比，模型組NOX2 的蛋白表達增加（P＜ 0.05）；與模型組相比，SCU 各治療組NOX2 的蛋白表達下降（P＜0.05）；陽性藥物治療組NOX2 表達下降（P＜ 0.05）。與正常組相比，模型組NOX4 的蛋白表達增加（P＜ 0.05）；與模型組相比，SCU 各治療組NOX4的蛋白表達下降（P＜ 0.05）；陽性藥物治療組NOX4 表達下降（P＜ 0.05），見圖5。

圖5 肝臟組織中NOX2、NOX4 的蛋白表達Fig.5 Protein expression of NOX2 and NOX4 in liver tissues

2.7 免疫組織化學結果顯示：

NOX2、NOX4 在肝細胞胞質內表達，呈黃棕色。與正常組相比，模型組肝臟細胞內光密度升高，NOX2、NOX4 蛋白表達增加（P＜ 0.05）；與模型組相比，SCU 各治療組肝臟細胞光密度降低，NOX2、NOX4 蛋白表達下降（P＜ 0.05）；陽性藥物治療組肝臟組織光密度降低，NOX2、NOX4 蛋白表達下降（P＜ 0.05）。免疫組織化學與Western blot 的NOX2、NOX4 趨勢一致（圖6）。

圖6 肝臟組織中NOX2、NOX4 蛋白的表達（×400）Fig.6 Expression of NOX2 and NOX4 proteins in liver tissue （×400）

3 討論

非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）已經成為全球最常見的慢性疾病之一，它是一種與肥胖相關的慢性肝病，由特定的遺傳背景、各種環境和代謝因素相互作用而導致的全身性疾病[11]。在NAFLD 的發生過程中常伴隨著伴有肝臟炎癥、纖維化以及晚期的肝硬化[12]。肝臟纖維化是各種慢性肝病發展過程中最常見的病理過程，也是決定肝病預后的關鍵因素[13]；早期的肝臟纖維化是一種可逆的傷口愈合過程，是以細胞外基質的沉積為特征的反應[14]。HSC 作為纖維化的主要媒介，在受損肝細胞產生的ROS 刺激下被激活并轉化為肌成纖維細胞（myofibroblasts，MFB）表型，參與到損傷修復中[15]。因此，在肝纖維化時期如果損傷因素持續存在，將會逐漸發展為肝硬化。肝纖維化可以通過抑制多種途徑（如：氧化應激，肝細胞損傷和HSC 激活）來得到逆轉[16]。中藥及其主要成分對復雜疾病的病理機制可以發揮綜合性的優勢，許多中藥都具有明顯的抗炎、抗氧化作用[17]。SCU是從傳統中草藥燈盞花中提取的主要成分，已經有600 多年的使用歷史[18]。有研究表明，SCU 具有清除氧自由基和抗氧化的作用[19]。另外，姜黃素（curcumin，CUR）是從姜黃根莖中提取的主要活性成分，許多研究已經表明姜黃素能夠改善脂肪變性、炎癥和纖維化進展，并且能在體外阻止HSC 的激活[20]。因此，CUR 在本實驗中作為陽性對照。在本研究中，通過高脂高糖飲食構建NAFLD 大鼠模型，在給予SCU 灌胃治療8 周后，發現不同濃度的SCU 和陽性藥物姜黃素治療后大鼠的體重、肝重和肝臟指數均下降，SCU 高劑量和姜黃素的治療效果較為明顯。為了判斷SCU 對肝臟組織脂質沉積的影響，筆者采用油紅“O”染色后表明，SCU 及姜黃素治療肝臟組織脂滴的面積減少，SCU 顯著改善脂質的沉積。Masson 染色的結果也發現，SCU 和姜黃素均能減輕膠原纖維的沉積。

在肝臟的膠原纖維的沉積導致的纖維化中，ROS 誘導的氧化應激扮演關鍵的角色。目前認為，氧化應激是抗氧化劑酶的活性不平衡，導致產生過量的ROS，過度的ROS 生成和積累參與了NAFLD 的進展[21]。對于ROS 的來源，主要是在線粒體和內質網中產生，其中線粒體是通過誘導電子運輸和解耦聯而產生ROS 的主要細胞器[22]。研究表明，NOX 和細胞色素氧化還原酶的催化作用是生成ROS 的主要方式。NOX 是肝細胞ROS生成的主要酶，HSC 和kuffer 細胞是肝臟中NOX表達的兩個關鍵細胞，KCs 促進NOX2 表達，HSC 增加NOX1、NOX2 和NOX4 表達，NOX 的表達上調，增加ROS 的合成，誘導氧化應激在肝臟纖維化過程中發揮著重要作用[23]。因此，筆者在NAFLD 的動物模型中，給予SCU 的治療后發現：NOX2 和NOX4 在NAFLD 的肝臟組織表達上調，ROS 在血清和肝臟組織的含量增加。通過不同濃度SCU 和姜黃素治療后：NOX2 和NOX4 在NAFLD 的肝臟組織表達下調，ROS 在血清和肝臟組織的含量降低。結果發現，NAFLD 的肝臟纖維化與NOX2 和NOX4 的表達增加，促進ROS 誘導買的氧化應激有關；SCU 和姜黃素能夠通過下調NOX2 和NOX4 的蛋白表達，減少ROS 的合成，抑制氧化應激，改善NAFLD 導致的肝臟纖維化。

綜上所述，SCU 能夠減輕NAFLD 的脂質代謝紊亂，其機制可能是降低肝臟組織NOX2 和NOX4 基因的表達，減少ROS 的合成，抑制ROS誘導的氧化應激，改善肝臟的纖維化。該研究將為SCU 治療NAFLD 誘導的肝臟纖維化提供科學的理論依據。