YLR358C 對釀酒酵母細胞壁完整性的調控

張 瑜 ，李夢妍 ，王捍英 ，郭艷芳 ，馬加慶 ，王衛群

（1）昆明醫科大學基礎醫學院;2）科技成果孵化中心，云南 昆明 650500）

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種單細胞真菌，是發酵工業中常用的菌株之一[1-2]。闡明真菌細胞壁合成和組裝的機理是真菌在工業上應用和發展的迫切需要，釀酒酵母被認為是研究真菌細胞壁生物學反應的理想模型。釀酒酵母的細胞壁是維持細胞形狀和保護內環境所需的細胞結構[3]，當釀酒酵母生長、發育或受到外界環境的干擾時，細胞壁的完整性被破壞。此時，細胞壁以高度調控和極化的方式重塑，這一過程主要受CWI 信號通路的調控[4]。YLR358C 是釀酒酵母未知的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。前期研究發現YLR358C 缺失株對細胞壁干擾劑敏感，提示YLR358 C 可能參與細胞壁完整性的調控[5]。但YLR358C 在細胞壁應激反應中的作用機制尚不清楚。本研究觀察釀酒酵母YLR358C缺失對細胞壁完整性的調控作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1 試劑

酵母基因組DNA 提取試劑盒、YPD 培養基組分蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、瓊脂購自上海生工生物技術有限公司；細胞壁干擾劑Calcofluor White （CFW）、剛果紅（CR）和十二烷基硫酸鈉（SDS）分別從BioFroxx 公司和生工生物技術有限公司獲得。

1.2 菌株和培養條件

野生型釀酒酵母（WT）保存于本實驗室；敲除酵母庫購于Horizon Discovery 有限公司。WT 酵母在YPD 固體和液體培養基中穩定繁殖，為了保持遺傳穩定性，敲除酵母需要在YPD 培養基中加入200μg/mL G418 進行培養。

1.3 YLR358C 基因敲除株的驗證

將YLR358C 敲除酵母以200 r/min 的轉速培養過夜，離心1 min 收集酵母，用上述試劑盒提取基因組DNA。以獲得的基因組為模板，以A、KanB、KanC 和D 為引物，對YLR358C 敲除酵母進行PCR 驗證，成功敲除的酵母命名為YLR358CΔ。為了探討YLR358C 是否參與釀酒酵母細胞壁完整性的調節，用不同濃度的細胞壁干擾劑處理YMR253CΔ 和WT 酵母，以檢測兩種酵母菌株的細胞生長狀態。

1.4 點板實驗

挑取WT 和YLR358CΔ 酵母單克隆，分別接種于10 mL 的YPD 液體培養基和含有200 μg/mL G418 的YPD 液體培養基中，在恒溫搖瓶中培養過夜。酵母液離心后，在新鮮的YPD 培養基中重懸細胞至OD600=1.0。然后分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，取2.5 μL 的稀釋液斑點于含有不同濃度CFW、SDS、CR 的YPD 板上，在28 ℃恒溫培養箱中孵育2 d，觀察生長情況。

1.5 CFW 染色

WT 和YLR358CΔ酵母單克隆在28 ℃、200 r/min 的恒溫搖床上培養至對數期。離心后，將細胞重懸于10 mL 含有30 μg/mL CFW 的YPD培養基中。酵母CFW 染色后，將細胞重懸于適量PBS 中，轉移至孔板上，靜置10～15 min 后倒置熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.6 顯微形態觀察

WT 和YLR358C 敲除酵母在28 ℃和200 r/min恒溫搖瓶下培養過夜。通過透射電子顯微鏡（美國Titan 公司）觀察酵母的顯微形態。

1.7 轉錄組測序與分析

將酵母離心后，提取總RNA，以mRNA 為模板合成并純化cDNA，最后通過PCR 富集獲得最終的cDNA 文庫。對cDNA 文庫進行測序，并將其與指定的參考基因組進行比較，獲得的圖譜數據進行文庫質量評估及生物信息學分析。

1.8 酵母總RNA 提取及實時定量PCR

離心收集酵母后，用Trizol 提取總RNA，逆轉錄合成cDNA 并進行實時定量PCR。獲取的結果使用公式2-ΔΔCt進行計算。

1.9 統計學處理

用SPSS 13.0 軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，2 組間比較用t檢驗，P＜ 0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 敲除YLR358C 干擾釀酒酵母細胞壁

結果發現，敲除YLR358C 后釀酒酵母的生長在含CFW、CR 和SDS 的培養基上受到明顯抑制，提示敲除YLR358C 影響釀酒酵母細胞壁完整性（圖1）。

圖1 敲除YLR358C 提高了釀酒酵母對細胞壁干擾劑的敏感性Fig.1 The YLR358C knockout increases the sensitivity of S.cerevisiae to cell wall interference reagents

2.2 YLR358CΔ 酵母細胞壁幾丁質的異常分布

經細胞壁干擾劑CFW 和SDS 處理后發現，與WT 酵母相比，YLR358CΔ 敲除酵母的幾丁質在細胞壁周圍積累更多（圖2A）。

對WT 菌株和YLR358CΔ 菌株進行了透射電鏡觀察，發現酵母細胞壁呈雙層結構。與WT 酵母相比，電子密度較低的YLR358CΔ 酵母突變體的細胞壁內部結構變薄（圖2B）。上述結果提示，YLR358CΔ 突變體對細胞壁干擾更敏感。

圖2 酵母細胞壁中的幾丁質受YLR358C 調控Fig.2 The chitin in the yeast cell wall is regulated by YLR358C

2.3 YLR358C 調控多種信號通路

用于轉錄組分析的組內樣本間相關系數R2的最小值為0.947，組間樣本間R2的最大值為0.848（圖3A）。因此，本研究的樣本選取是合理的。利用DESeq2 軟件，以P＜ 0.05，變化倍數≥2.0 倍為差異表達的閾值，篩選出的差異表達基因共1 659 個，其中下調基因931 個，上調基因728 個 （圖3B，3C），YLR358C 敲除后的釀酒酵母差異基因的氣泡圖顯示了KEGG 富集分析結果（圖3D）。

圖3 R358C 基因敲除和轉錄組分析Fig.3 YLR358C knockout and transcriptome analysis

2.4 細胞壁完整性途徑可能受到YLR358C 的調控

轉錄組分析結果提示CWI 信號通路中的WSC3、SWI4 和HSP12 等幾個關鍵因子異常表達。SWI4 和WSC3 mRNA 在YLR358CΔ 酵母中的表達量上調，其中WSC3 的上調更為明顯。與WT酵母相比，HSP12 的表達降低（圖4）。

圖4 R358C 調控細胞壁應激反應通路中WSC3、SWI4 和HSP12 的表達水平Fig.4 YLR358C regulates the expression levels of WSC3，SWI4，and HSP12 in the cell wall stress response pathway

3 討論

釀酒酵母是一種存在細胞壁的單細胞真核生物。當酵母細胞面臨各種環境壓力時，細胞壁不斷地重構[6-8]。酵母甘露蛋白在改善葡萄酒品質方面具有防止渾濁、降低澀味、保留香氣成分、刺激乳酸菌生長等優點[9]。因此，明確釀酒酵母細胞壁相關基因的作用，可以改變酵母特性，優化發酵工藝，對食品、醫藥和發酵行業具有重要意義[10-11]。本研究發現，YLR358C 基因缺失的釀酒酵母在含有細胞壁干擾劑的培養基上生長受到抑制。YLR358C 基因敲除株對細胞壁干擾劑敏感。CFW 染色顯示細胞壁幾丁質合成增加，細胞側壁積累過多。轉錄組測序和生物信息學分析表明，YLR358C 基因可能參與了釀酒酵母CWI 信號通路的調控。轉錄組分析發現CWI 信號通路中的WSC3、SWI4和HSP12 基因在YLR358CΔ 酵母中異常表達。PCR 結果顯示，WSC3 和SWI4 在YLR358CΔ酵母中表達上調，而HSP12 在YLR358CΔ 酵母中表達下調，這與轉錄組結果一致。

總之，本研究發現YLR358C 參與細胞壁完整性的調節，其作用可能是通過調節CWI 信號通路介導的。對YLR358C 進行更深入的功能和機理研究，希望為食品、醫藥、發酵等行業的發展提論理論依據。