LEA、CDw75 在大腸腺癌組織中的表達及其臨床意義

沈 紅 ，華海蓉 ，高麗萍 ，何易曉 ，楊學智 ，曾祥菲 ，王 芳 ，宋精玲

（1）昆明醫科大學基礎醫學院病理學與病理生理學系，云南 昆明 650500;2）昭通市第一人民醫院病理科，云南 昭通 657000;3）電子科技大學醫學院，綿陽市中心醫院病理科，四川 綿陽 621000;4）四川大學華西醫院臨床病理科，四川 成都 610000;5）昆明醫科大學電鏡室，云南 昆明 650500）

大腸癌（colorectal carcinoma，CRC）是消化道最多見的惡性腫瘤之一[1]，近年來發病率呈總體上升態勢。由于大部分癌前病變發展為結直腸癌需要較長的時間（約10 a），早期癥狀又不明顯，故不易被發現，在明確診斷前大多數患者多被延誤3～6 個月或更長，甚至被誤診為慢性腸炎、肛瘺等疾病，從而喪失最好的治療時機。所以，大腸癌的預防、篩查、早期診斷及治療顯得非常重要。

結直腸癌是最合適選擇篩查和預防的腫瘤，有效的篩查可以提高癌癥的一級預防。已證實，大腸癌篩查能通過切除其癌前病變腺瘤性息肉來阻止疾病發生和發展，極大地降低患者的死亡率[2-3]。因此，找到一種對大腸癌靈敏度和特異度較高的分子生物學標記物，獲得操作方便、成本低、效益好、臨床實操性強的篩查方法，用于大腸癌的早期臨床檢測和人群普查，使腺瘤等癌前病變和早期大腸癌得以發現，而不至于耽誤病情，降低大腸癌的發生率和患者死亡率就顯得尤為重要。

大分子外部抗原（large external antigen，LEA）是一種膜表面腫瘤相關抗原，分子量 ＞ 500 KD[4]，其抗原決定簇位于抗原的糖鏈部分上，成分為唾液酸[5-6]，由細胞粗面內質網合成，并可排泌到細胞外，在大腸癌患者的血清和腹水中能夠被檢測到。分化抗原簇75（cluster of differentiation antigen 75，CDw75）是由β-半乳糖苷α-2，6 唾液酸轉移酶產生的糖綴合物唾液酸化的產物，部分學者通過研究CDw75 與胃癌的關系得出：被唾液酸化的CDw75 與胃癌的侵襲轉移潛能密切相關。

本實驗用免疫組化方法對人正常大腸黏膜、大腸腺瘤、淋巴結無轉移大腸腺癌及淋巴結有轉移大腸腺癌組織進行LEA 及CDw75 表達檢測，并分析LEA、CDw75 表達趨勢與大腸腺癌及其預后的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源樣本選自昆明醫科大學病理學教研室尸檢及昭通市第一人民醫院2008 年1 月～2012 年12 月期間進行手術切除、臨床資料完整的存檔蠟塊，共126 例。其中，正常大腸黏膜11 例、大腸腺瘤43 例、淋巴結無轉移大腸腺癌51 例、淋巴結有轉移大腸腺癌21 例。所有標本均由2 位病理學專家復閱，尸檢結腸黏膜組織來源者均無結直腸的病變，大腸腺癌標本剔除了黏液腺癌和印戒細胞癌。腫瘤診斷標準按2019 年消化系統腫瘤WHO 分類[7]進行。所有大腸腺癌患者術前和術后均未進行放療和化療。入圍大腸腺癌患者均以電話方式進行隨訪，隨訪日期自病理報告確診日期算起，至2021 年12 月31 日，并嚴格記錄隨訪情況，72 例大腸腺癌患者隨訪到45 例，失訪27 例；隨訪結局定義為死亡。

1.1.2 主要試劑ND-1 抗體購自Abcam，LN-1抗體購自SANTA cruz biotechnology，UltraSensitiveTM即用型超敏試劑盒（兔）、UltraSensitiveTM即用型超敏試劑盒（鼠）、DAB 顯色加強型試劑盒、EDTA型抗原修復緩沖液等購于福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2 方法

HE 及免疫組化：所有標本均為10%福爾馬林固定、石蠟包埋，4 μm 厚連續切片，常規HE染色和免疫組化染色，免疫組化染色方法按試劑盒說明進行。ND-1 抗體（檢測LEA）和LN-1 抗體（檢測CDw75）的稀釋濃度均為1∶250。LEA、CDw75 的陽性表達物呈淡黃～棕黃色顆粒，主要位于細胞膜和/或細胞質，散在或成團分布。采用雙盲法觀察切片，以半定量積分法[8]判斷結果，評分由陽性細胞百分比及陽性強度綜合評判得出。（1）陽性細胞百分比：陽性細胞數≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞ 75%為4 分；（2）陽性強度：無色為0 分，淡黃色為1 分，黃色為2 分，棕黃色為3 分。最終評分=陽性比率評分×陽性強度評分：0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為陽性（++），9～12 分為強陽性（+++）。

1.3 統計學處理

應用SPSS21.0 統計軟件包，采用Nonparametric Tests 中的Independent Samples 過程用于半定量積分計數資料；采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗用于多樣本間總體比較；各組之間行Mann-Whitney 兩兩比較，P＜ 0.05 為差異有統計學意義；生存分析使用Cox 回歸模型。

2 結果

2.1 病例資料

11 例正常大腸黏膜組織標本（來源于尸檢材料），年齡23～75 歲，平均57 歲；43 例大腸腺瘤組織標本，年齡27～75 歲，平均58 歲；51 例淋巴結無轉移大腸腺癌組織，年齡33～75 歲，平均55 歲；21 例淋巴結有轉移大腸腺癌組織，年齡23～75 歲，平均56 歲。高分化癌26 例，中分化癌28 例，低分化癌18 例。管狀腺瘤26 例，絨毛狀腺瘤17 例。

2.2 LEA 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺癌組織中的表達

LEA 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺癌組織中均有不同程度的陽性表達（圖1～圖4），且陽性表達有逐漸增強的態勢，正常大腸黏膜、大腸腺瘤與大腸腺癌（包括淋巴結有轉移和無轉移）比較差異有統計學意義（P=0.000，P=0.006）；淋巴結有轉移的大腸腺癌組織的陽性表達率雖略高于淋巴結無轉移的大腸腺癌組織，但差異無統計學意義（P=1.000）；LEA 在高分化大腸腺癌中的表達低于中、低分化大腸腺癌，且高分化與中、低分化大腸腺癌之間差異有統計學意義（P=0.001 和P=0.000），LEA 在管狀腺瘤與絨毛狀腺瘤的表達差異也有統計學意義（P=0.023），見圖5～圖7 及表1～表3。

表1 LEA 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺癌中的表達（n）Tab.1 The expression of LEA in normal colorectal mucosa，colorectal adenoma and colorectal carcinoma （n）

表2 LEA 在不同分化程度大腸腺癌中的表達（n）Tab.2 The expression of LEA in colorectal adenocarcinoma with different degrees of differentiation （n）

表3 LEA 在大腸腺瘤中的表達（n）Tab.3 The expression of LEA in colorectal adenoma （n）

圖1 正常大腸黏膜LEA 呈弱陽性表達（SP×200）Fig.1 The weakly positive expression of LEA in normal colorectal mucosa （SP×200）

圖2 大腸腺瘤LEA 呈陽性表達（SP×200）Fig.2 The positive expression of LEA in colorectal adenoma （SP×200）

圖3 淋巴結無轉移大腸腺癌LEA 呈強陽性表達（SP×200）Fig.3 The strong positive expression of LEA in colorectal adenocarcinoma without regional lymph node metastasis （SP×200）

圖4 淋巴結有轉移大腸腺癌LEA 呈強陽性表達（SP×200）Fig.4 The strong positive expression of LEA in colorectal adenocarcinoma with regional lymph node metastasis （SP×200）

圖5 LEA 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸腺癌組織中的表達分布Fig.5 Distribution of LEA expression in normal colorectal mucosa, colorectal adenoma and colorectal adenocarcinoma

圖6 LEA 在不同分化程度大腸腺癌中的表達分布Fig.6 Distribution of LEA expression in colorectal adenocarcinoma with different degrees of differentiation

圖7 LEA 在大腸腺瘤中的表達分布Fig.7 Distribution of LEA expression in colorectal adenoma

2.3 CDw75 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺癌組織中的表達

CDw75 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺癌組織中均有不同程度的陽性表達（圖8～圖11），且陽性表達有逐漸增強的態勢，正常大腸黏膜、大腸腺瘤與大腸腺癌（包括淋巴結有轉移和無轉移）比較差異有統計學意義（P=0.000，P=0.007），淋巴結有轉移的大腸腺癌組織的陽性表達率雖略高于淋巴結無轉移的大腸腺癌組織，但差異無統計學意義（P=1.000）；CDw75 在高分化大腸腺癌中的表達低于中、低分化大腸腺癌，且高分化與中、低分化大腸腺癌之間差異有統計學意義（P=0.000 和P=0.001），CDw75 在管狀腺瘤與絨毛狀腺瘤的表達差異也有統計學意義（P=0.000），見圖12～圖14 及表4～表6。

表4 CDw75 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤、大腸腺癌中的表達（n）Tab.4 The expression of CDw75 in normal colorectal mucosa，colorectal adenoma and colorectal carcinoma （n）

表5 CDw75 在不同分化程度大腸腺癌中的表達（n）Tab.5 The expression of CDw75 in colorectal adenocarcinoma with different degrees of differentiation （n）

表6 CDw75 在大腸腺瘤中的表達（n）Tab.6 The expression of CDw75 in colorectal adenoma （n）

圖8 正常大腸黏膜CDw75 呈弱陽性表達（SP×200）Fig.8 The weakly positive expression of CDw75 in normal colorectal mucosa （SP×200）

圖9 大腸腺瘤組織CDw75 呈陽性表達（SP×200）Fig.9 The positive expression of CDw75 in colorectal adenoma （SP×200）

圖10 淋巴結無轉移的大腸腺癌組織CDw75 呈強陽性表達（SP×200）Fig.10 The strong positive expression of CDw75 in colorectal adenocarcinoma without regional lymph node metastasis （SP×200）

圖11 淋巴結有轉移的大腸腺癌組織CDw75 呈強陽性表達（SP×200）Fig.11 The strong positive expression of CDw75 in colorectal adenocarcinoma with regional lymph node metastasis （SP×200）

圖12 CDw75 在正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸腺癌組織中的表達分布Fig.12 Distribution of CDw75 expression in normal colorectal mucosa, colorectal adenoma and colorectal adenocarcinoma

圖13 CDw75 在不同分化程度的大腸腺癌中的表達分布Fig.13 Distribution of CDw75 expression in colorectal adenocarcinoma with different degrees of differentiation

圖14 CDw75 在大腸腺瘤中的表達分布Fig.14 Distribution of CDw75 expression in colorectal adenoma

2.4 生存分析

納入生存分析的病例數共45 例，生存27 例，死亡18 例。Cox 回歸分析中可用案例加權后為1 086（占比42.2%），刪失案例加權后為1 486（占比57.8%）；刪除案例中，帶有缺失值的案例、帶有負時間的案例、層中最早事件之前刪失的案例均為0。加權規則為年齡。

將患者生存時間的影響因素采用Cox 回歸分析，協變量為患者性別、年齡、臨床分期、淋巴結轉移與否、LEA 和CDw75 表達情況，采用向前法進行變量篩選，結果顯示患者性別、年齡、臨床分期、LEA 和CDw75 表達是影響大腸腺癌患者預后的因素。年齡越大、臨床分期越高、LEA 和CDw75 表達越強，患者死亡風險越大；男性患者的死亡風險大于女性患者，見表7 和圖15。

圖15 各協變量的均值水平的生存曲線Fig.15 Survival curves for the mean level of each covariate

表7 多因素 COX 比例風險回歸模型Tab.7 Multivariate COX proportional hazards regression model

3 討論

隨著社會經濟的發展，人類膳食結構的改變，膳食纖維在人們日常飲食中的比例日趨減少，導致大腸腺癌發病率逐年上升。有數據顯示，世界上大腸腺癌正以2 %的平均速率呈連年上升趨勢[9]，而在中國，大腸腺癌的發病增長率是國際水平的2 倍有余[10]，因此，大腸腺癌已成為嚴重威脅國人健康的危險因素之一。

從大腸腺瘤發展到大腸腺癌約7～l2 a[11]。要提高人類大腸腺癌的生存時限，唯有找到能及時發現、早期篩查大腸腺癌的診斷方法，或對大腸腺癌具有特異性的分子生物學指標。

3.1 LEA 在臨床病理中的應用

據近幾年的研究報道，LEA 是中、高分化大腸腺癌特異性較強的腫瘤相關抗原[5-6]。同時，眾多實驗研究發現，LEA 也存在于絨毛狀腺瘤和重度異型腺瘤組織中，其含量與大腸絨毛狀腺瘤組織中絨毛的數量和腺瘤細胞分化程度有關，伴隨絨毛數量的增多、腺瘤細胞分化程度降低，LEA 含量逐漸增多，并與大腸腺癌中的含量逐漸接近，說明，在大腸腺瘤組織與大腸腺癌組織中含有共同的LEA 抗原[12]。筆者的實驗結果也顯示絨毛狀腺瘤中LEA 表達增多，因此，對大腸腺瘤組織進行LEA 檢測，或有助于預測大腸腺瘤的惡變傾向，對早期發現大腸腺癌提供又一新的檢測指標。

已報道可用于大腸腺癌診斷的血清腫瘤標記物主要有CEA、CA19-9、CA50、CA242 等，這些腫瘤相關抗原的血清學檢查均已普遍地應用于大腸腺癌的臨床診斷和普查。其中，CEA 的應用最廣泛，但CEA 的特異性不強，在大腸腺癌及其他腫瘤患者的血清中均可升高[13-14]。對某些內胚層來源的非大腸腺癌組織進行單克隆抗體ND-1對LEA 的特異性識別實驗，發現LEA 在內胚層來源的非大腸腺癌組織中的表達陽性率要明顯低于大腸腺癌組織[15]。

本實驗發現，LEA 在大腸腺癌發生發展過程中表達逐漸升高，且在不同分化程度大腸腺癌中的表達差異有統計學意義，因此，筆者認為LEA在大腸腺癌發生發展中起一定的作用。

3.2 CDw75 在臨床病理中的應用

CDw75 是一種人白細胞表面抗原，位于具有免疫球蛋白陽性表達的成熟B 淋巴細胞表面，是β-半乳糖苷α-2，6 唾液酸轉移酶產生的糖綴合物唾液酸化產物[16-20]。大多數惡性腫瘤患者死亡的直接原因是腫瘤的侵襲與轉移[19]，而癌細胞之所以能發生侵襲和轉移，是由于細胞表面糖蛋白和糖脂的組成及結構不斷發生變化[16-17]。有研究顯示，細胞表面的糖綴合物與細胞的增生、黏附、轉移能力和免疫原性有重要關系[16-18]。其機理[21-22]可能是唾液酸降低了腫瘤細胞與Ⅳ型膠原的黏附、封閉了抗原決定簇、阻礙自然殺傷細胞的活性，并通過延長血漿中糖綴合物的半衰期誘導免疫耐受。

在胃腸道腫瘤研究中發現，CDw75 在胃黏膜上皮細胞的表達是其惡性轉化和侵襲的標志，也是一個獨立的胃癌預后因子[23]。有研究顯示，CDw75 并不是β-半乳糖苷α-2，6 唾液酸轉移酶本身，而是β-半乳糖苷α-2，6 唾液酸轉移酶產生的糖綴合物唾液酸化產物。被唾液酸化的糖綴合物與腫瘤細胞的侵襲、轉移能力密切相關[18,24-25]。

在本研究中，CDw75 在11 例大腸黏膜組織中只有1 例（9.09%）為陽性表達，而在72 例大腸腺癌組織中有51 例（70.83%）呈陽性表達，但將51 例淋巴結無轉移大腸腺癌和21 例淋巴結有轉移的大腸腺癌的CDw75 結果進行統計學分析，發現CDw75 與大腸腺癌是否伴有淋巴結轉移差異無統計學意義。

本次研究認為LEA、CDw75 在大腸腺癌發生發展過程中有一定作用；患者性別、年齡、臨床分期、LEA 和CDw75 表達是影響大腸腺癌患者預后的因素，年齡愈大、臨床分期愈高、LEA 和CDw75 表達越強，患者死亡風險愈大；女性患者的死亡風險小于男性患者。在本次生存分析中顯示有淋巴結轉移的患者死亡風險比無淋巴結轉移的患者小，筆者考慮可能是因為隨訪到的有淋巴結轉移的病例數較少所致[因為從死亡率的占比來講，有淋巴結轉移患者的死亡率（50%，5/10）高于無淋巴結轉移患者的死亡率（37.14%，13/35）]。