上調miR-328-5p對乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

李建梅，孫靜宜，馬英橋，趙 月，李建柱

miRNAs是一類長度約為18．25個堿基的內源性非編碼小分子RNA，可降解mRNA并抑制翻譯，主要通過與其靶mRNA的3' 端結合從而達到調節(jié)基因表達的目的[1]。miRNAs可參與細胞增殖、凋亡、代謝等生物學過程，在腫瘤等多種疾病中表達失調[2]。miRNAs也是乳腺癌的重要調節(jié)因子，其表達改變與乳腺癌的發(fā)生密切相關[3]。有趣的是，miR-328還被發(fā)現在RB143人視網膜母細胞瘤細胞分離出的ABCG2+(干細胞樣)中水平比ABCG2-(非干樣)中低，而miR-328在乳腺癌干細胞中的作用依然未知[4-5]。本研究旨在分析miR-328-5p在乳腺癌細胞系中的表達及上調miR-328-5p表達對乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1細胞系 乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231及正常乳腺上皮細胞系MCF10A均購于美國ATCC細胞庫。

1.2主要試劑與儀器 胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，細胞計數試劑盒(CCK-8)購自上海碧云天公司，LipofectamineTM2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司，Transwell小室(批號：845116)購自吳江康寧生命科學有限公司，Matri-gel基質膠及細胞培養(yǎng)基均購自美國BD公司，miR-328-5p和miR-con(批號：121547)均購自上海美軒生物科技有限公司。PCR儀(Applied Biosystems ABI7500)，化學發(fā)光儀(Promega 30IOC)，凝膠成像系統(Bio-rad ChemiDoc XRS)，透射電鏡(Thermo fisher Spectra S/TEM)，熒光顯微鏡(Olympus BX53)，光學顯微鏡(Olympus CX33)，相差顯微鏡(Olympus CKX53)。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng)及制備：乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231及正常乳腺上皮細胞系MCF10A均于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中加入雙抗霉素-鏈霉素，然后置于恒溫箱中恒溫培養(yǎng)，選擇對數生長期細胞進行實驗。

1.3.2細胞轉染：選取生長狀態(tài)良好的乳腺癌細胞，分為3組：miR-328-5p組(進行miR-328-5p轉染)、轉染對照組(轉染miR-con)及空白對照組。按照LipofectamineTM2000說明書進行瞬時轉染。轉染6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.3.3miR-328-5p表達檢測：采用qPCR[6]檢測miR-328-5p RNA水平。使用miRNA提取試劑盒從細胞中提取RNA，按照逆轉錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit和SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit試劑盒進行逆轉錄和qRT-PCR。miR-328-5p反應體系為，95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火32 s，循環(huán)50次。通過計算機系統自動分析各樣本Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miRNA的相對表達量。

1.3.4細胞增殖：采用CCK-8實驗[7]及平板克隆形成實驗[8]檢測細胞增殖能力。以3000個細胞/孔(調整細胞濃度為100 pl含3000個細胞)將處于對數生長期的MCF-7細胞鋪于96孔板中，并進行轉染培養(yǎng)。每組重復3次，培養(yǎng)48 h，加入CCK-8試劑10 μl，室溫孵育4 h，酶標儀測定450 nm波長處的吸光度值(OD450)。以適當細胞密度將處于對數生長期的MCF-7細胞鋪于細胞培養(yǎng)皿中進行轉染分組培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后將平皿倒扣于帶網格的膠片上，計數克隆數，將>50個細胞的克隆數拍照記錄保存。最后計算克隆形成率，克隆形成率=(克隆數/接種細胞數)×100%。

1.3.5細胞遷移：采用細胞劃痕實驗[9]檢測細胞遷移情況。同“1.2.4”項下進行細胞轉染分組后，用胰酶消化細胞，離心后通過無血清基礎的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸計數后稀釋，稀釋成4×106個/ml的細胞懸液，取100 μl鋪于Transwell上室，下室加入600 μl含血清完全培養(yǎng)基。均培養(yǎng)24 h后，采用4%多聚甲醛固定15 min，將上室未遷移的細菌擦拭干凈，結晶紫染色，記錄細胞遷移數。

1.3.6細胞侵襲：行Transwell體外細胞侵襲實驗[10]，拍照計算細胞侵襲數，每組實驗設計6個復孔。

1.4研究方法 觀察不同乳腺癌細胞系中miR-328-5p相對表達量及上調miR-328-5p表達對MCF-7細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響。

2 結果

2.1不同細胞系中miR-328-5p相對表達量比較 正常乳腺上皮細胞系MCF10A、乳腺癌細胞系MCF-7和乳腺癌細胞系MDA-MB-231中miR-328-5p相對表達量分別為1.00±0.02、0.42±0.07、0.48±0.06，miR-328-5p相對表達量正常乳腺上皮細胞系MCF10A>乳腺癌細胞系MDA-MB-231>乳腺癌細胞系MCF-7(P<0.05)。

2.2上調miR-328-5p表達對MCF-7細胞增殖能力的影響 與轉染對照組和空白對照組比較，miR-328-5p組MCF-7細胞增殖率、克隆形成率均明顯降低(P<0.05)，轉染對照組與空白對照組MCF-7細胞增殖率、克隆形成率比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 上調miR-328-5p表達對MCF-7細胞增殖能力的影響

2.3上調miR-328-5p表達對MCF-7細胞遷移、侵襲能力的影響 與轉染對照組、空白對照組比較，miR-328-5p組MCF-7細胞遷移、侵襲能力均明顯降低(P<0.05)，轉染對照組與空白對照組MCF-7細胞遷移、侵襲能力比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 上調miR-328-5p表達對MCF-7細胞遷移、侵襲能力的影響個)

3 討論

乳腺癌是一種發(fā)生于乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[11]。目前根據相關調查資料顯示：不良生活習慣、高強度工作、快節(jié)奏生活及精神壓力等多種因素均與乳腺癌發(fā)病進展有著密切聯系，其發(fā)病率逐漸升高[12]。手術為乳腺癌治療的首選方案，隨著對乳腺癌認知的增加、醫(yī)療技術的進步，乳腺癌的治療取得了階段性的進展，但關于其具體發(fā)病機制仍舊尚未明確，故探索新的分子靶點對治療乳腺癌及改善其預后至為關鍵[13-14]。近年研究表明，miRNAs在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及惡性轉化過程中起重要作用[15]。為進一步探討miR-328-5p與乳腺癌發(fā)病、惡化之間的關系，本文以乳腺癌細胞系MCF-7和MDA-MB-231及正常乳腺上皮細胞系MCF10A為標本進行研究。

既往多項研究發(fā)現，在非小細胞肺癌、胃癌等多種惡性腫瘤進展中，長鏈非編碼RNA或環(huán)狀RNA通過調控miR-328-5p表達起關鍵作用，故檢測miR-328-5p表達有望成為評估多種惡性腫瘤的有效手段[16-17]。MCF-7細胞與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關。本研究結果示，乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231中miR-328-5p相對表達量均顯著低于正常乳腺上皮細胞系MCF10A，提示miR-328-5p表達與乳腺癌的發(fā)生有著密切聯系。既往報道，miR-328-5p作用于乳腺癌并抑制MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖的主要機制為靶向糖基化終產物受體[18]。本文經CCK-8、平板克隆實驗得出，上調miR-328-5p的乳腺癌MCF-7細胞增殖、克隆形成能力均顯著降低。另也有文獻證實：circRNA-5692可通過刺激miR-328-5p增強殘疾基因同源物2相互作用蛋白表達從而抑制肝癌的進展，長鏈非編碼RNA TPTEP1競爭性抑制miR-328-5p從而抑制非小細胞肺癌細胞的增殖[19-20]。除此之外，本文通過細胞劃痕實驗、Transwell體外細胞侵襲實驗得出，上調miR-328-5p對乳腺癌MCF-7細胞的遷移、侵襲能力有明顯抑制作用，從而控制延緩乳腺癌病情的進展。推測miR-328-5p對乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的抑制作用可能與PI3K/AKT通路的激活調節(jié)有關。

綜上，miR-328-5p在乳腺癌細胞中低表達，上調miR-328-5p表達可抑制乳腺癌細胞的增殖能力和減弱遷移、侵襲能力，可能成為乳腺癌臨床診斷、評估及治療的新靶點。