酶聯免疫法測定豬尿中克倫特羅殘留的檢測與分析

曹忠君

（鐵嶺市畜產品安全檢測站，遼寧 鐵嶺 112000）

在現代化畜牧業養殖過程中，普遍存在著用于提高經濟動物產品產量的藥物及違禁品被廣泛濫用的現象，鹽酸克倫特羅就是其中最常用的一種。它屬于擬腎上腺素類藥物，被人們意外發現鹽酸克倫特羅可明顯促進經濟動物生長，顯著提高瘦肉率。能夠促進動物肌肉生長，特別是機體蛋白質的合成，阻礙脂肪的形成，從而改善肉品質，所以鹽酸克倫特羅又稱為“瘦肉精”。大量試驗證明，鹽酸克倫特羅在動物體內蓄積殘留的主要器官和組織是，肝、眼睛、肌肉、肺、毛發、腎和脂肪組織。藥物殘留對環境、人體健康、畜牧業健康發展等方面影響極大。近年來，我國政府及相關部門對獸藥的科學用藥和殘留檢測極為重視，因此應重視對鹽酸克倫特羅的檢測。

本研究旨在探討應用酶聯免疫法檢測豬尿中克倫特羅殘留的方法，同時也為了監測某地區屠宰的生豬克倫特羅殘留的現狀。結果表明，該方法具有快速、簡單、準確、檢測成本不高的特點，本次試驗檢測數據全部合格。本方法適用于大批量檢測，便于基層檢測機構以及屠宰企業應用，能夠起到監測經濟動物藥物使用情況的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器和設備

DNM9602G型酶標分析儀(配備450納米濾光片)；CF160RXⅡ型高速立式冷凍離心機；恒溫培養箱（可調至25℃）；可調式移液器（規格為50微升、300微升、1000微升）；八道移液器（規格為300微升）；移液器吸頭50微升、300微升、1000微升；吸水紙。

1.2 試劑和材料

除應具有實驗室常用玻璃器皿和實驗用水（應符合GB/T 6682中一級水的要求）外，還應準備克倫特羅酶聯免疫試劑盒，應保存于2～8℃冰箱中，試劑盒應包括如下試劑耗材。

（1）96孔板(12條×8孔)包被有針對克倫特羅IgG的包被抗抗體。（2）克倫特羅系列標準品樣液(至少有5個倍比稀釋濃度水平，附加1個空白對照)。（3）克倫特羅抗體(濃縮液)和過氧化物酶標記物(濃縮液)。（4）發色劑（四甲基聯苯胺）和酶底物（過氧化尿素）。（5）緩沖液（酶標記物及抗體濃縮液稀釋用）和反應終止液（1摩爾/升硫酸）。

競爭酶標記物的稀釋：提供的競爭酶標記物為濃縮液。由于稀釋的酶標記物不穩定，僅需稀釋實際用量的酶標記物。用緩沖液以1∶10的比例稀釋酶標記物濃縮液(如400微升濃縮液+3.6毫升緩沖液，足夠4個微孔板條32孔用)。

克倫特羅抗體的稀釋：克倫特羅抗體濃縮液穩定適合長期放置，由于稀釋的克倫特羅抗體穩定性變差，僅需稀釋實際需要用量的克倫特羅抗體即可。用緩沖液以1∶10的比例稀釋抗體濃縮液(如400微升濃縮液+3.6毫升緩沖液，足夠4個微孔板條32孔用)。

包被有抗抗體的微孔板條的使用：將錫箔袋沿橫向邊壓皺外沿剪開，取出需用數量的微孔板放置在框架上，將剩余的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于4℃冰箱中。

1.3 方法

樣品制備：尿液清澈可直接上樣，若渾濁先離心(5000轉/分鐘)10分鐘，備用。

試驗步驟：（1）使用前使試劑和材料恢復到室溫。（2）將標準和試樣所用數量的孔條插人微孔架。（3）加入100微升準確稀釋好的抗體溶液到每一個微孔中，充分混合并在室溫（或放置25℃培養箱中）孵育15分鐘。（4）倒出所有孔中的液體，倒置在吸水紙上拍打(每行拍打4次)，用力應均勻，防止用力過大甩出孔條。用250微升實驗用水充入孔中，輕輕搖晃后倒出微孔中液體，再重復操作3遍以上。（5）加入20微升的處理好的尿液或標準到微孔中，試樣和標準至少做兩個平行實驗。（6）加入100微升已經稀釋過的酶標記物，25±2℃孵育30分鐘。（7）全部倒出孔中的混合液體，在吸水紙上拍打(每行拍打4次)。用250微升實驗用水充入孔中，倒出微孔中液體，再重復操作3次以上。（8）迅速加入50微升酶底物和50微升發色試劑到微孔中，室溫孵育15分鐘。（9）加入100微升停止液到每個微孔中，盡快在450納米波長處的酶標分析儀測量，微孔加停止液后為深淺不同的黃色，顏色越淺表示克倫特羅含量越高。

結果計算：

先計算相對吸光度值。按下式計算：

相對吸光度值(%)=B/B×100

式中：

B——標準(或試樣)溶液的吸光度值；

B——空白(濃度為0的標準溶液)的吸光度值。

式中：

——試樣中克倫特羅的含量，單位為微克每千克(或微克每升)。

——試樣吸光度值(%)對應的克倫特羅量，單位為微克每升。

——試樣的稀釋倍數。

——試樣的取樣量，單位為克(或毫升)。

2 結果與分析

2.1 標準曲線分析

由圖1可以看出相關系數R=0.9998，表明吸光度和克倫特羅含量濃度線性相關性高，標準品使用準確，酶標分析儀性能正常、調試良好。

圖1 酶聯免疫法測定克倫特羅含量標準曲線

2.2 方法回收率分析

本研究共進行10次實驗，為了保證檢測的準確度，每次實驗附帶一批次空白樣品和兩批次質控樣品，添加回收濃度為，1微克/升和2微克/升，其回收率均在74.3%～109.7%，說明尿液中克倫特羅成分損失小，酶聯免疫試劑盒試劑材料有效，檢測方法、實驗操作步驟正確，測試數據準確、真實。

2.3 樣品結果分析

檢測結果顯示，從某地區不同屠宰場隨機抽取的100批次豬尿樣品中克倫特羅含量均未超過酶聯免疫試劑盒檢出限，合格率為100%。

3 討論

酶聯免疫法檢測藥物殘留成本低、特異性高，適合大批量樣品檢測，實用性強。筆者根據檢驗檢測工作多年經驗，總結以下幾點該檢測方法操作注意事項供基層檢測機構和屠宰企業檢測人員參考：（1）當今酶聯免疫試劑盒生產廠家很多，應加以考察和質量驗證，使用質量符合要求的產品。（2）每次實驗都應同時做空白對照和陽性添加對照，做好質量控制，且做平行樣品。

（3）完全按照其步驟操作，不可省略、顛倒步驟。（4）試劑盒使用前，將試劑盒內各組份置于室溫，待其恢復至室溫（25±2℃），方可使用。使用后請立即將試劑及包被有抗抗體的微孔板條放回 2～8℃冰箱中保存，但也不要反復恢復室溫再冷藏（一般建議酶聯免疫試劑盒3次實驗內用完），否則吸光度值下降，數據準確度下降。（5）各試劑在使用前需搖勻，濃縮液一定注意稀釋后使用。（6）檢測時，應盡量減少板孔上方空氣流動，加入試劑應迅速且準確。（7）不同標準品、樣品所用吸頭不得混用，防止污染及反應。（8）移液器吸取試劑時應避免出現氣泡，否則試劑加入量不準確，有氣泡應推出液體重新吸取。（9）終止液中含有硫酸，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。