基于SSR標記的藜麥種質資源遺傳多樣性分析與指紋圖譜構建

陳翠萍， 劉 洋

[1.青海大學農林科學院，青海西寧 810016； 2.農業農村部植物新品種測試(西寧)分中心，青海西寧 810016]

藜麥(Willd)，莧科藜屬植物，異源四倍體(2n=4x=36)，原產于南美洲安第斯山區，具有耐寒、耐鹽、耐干旱的生長特性。因含有豐富而全面的營養價值，被印加人稱為“糧食之母”。我國于20世紀90年代從國外引入藜麥并進行適應性栽培，先后在我國西藏、甘肅、青海等地進行引種、新品種選育及適應性評價等工作。對藜麥分子標記和遺傳多樣性方面已有部分研究。陸敏佳等利用16對SSR標記對41個藜麥種質的多態性及其親緣關系進行分析，16對引物的平均多態信息含量為0.366。宋嬌利用46對簡單重復序列(SSR)標記對114份藜麥材料共擴增出165條多態性條帶，聚類分析表明不同來源地的種質具有一定的遺傳相似性，相同來源地的材料也分到了不同組群。孫夢涵等利用66對SSR標記對163份藜麥種質和3份中國臺灣紅種質進行種質群體的多態性和親緣關系分析，結果表明玻利維亞和秘魯種質與美國和智利種質的遺傳信息存在明顯區分，青海和云南的藜麥種質在親緣關系上接近安第斯高原型，河北、山西的藜麥種質更接近智利低海拔型，臺灣紅藜為臺灣本土種質。吳文強等利用18對SSR標記在96份藜麥上共檢測出192個等位基因條帶，遺傳相似系數平均值為0.789 5，可為篩選適合貴州地區有效推廣、種植、應用的藜麥材料提供參考。大量研究表明，SSR分子標記對評價藜麥種質資源遺傳多樣性的可行性具有重要意義，但對所選擇的藜麥SSR分子標記的染色體位置是否分布均勻等信息均不明確，不利于所選SSR標記的廣泛推廣和利用。Jarvis等公布了高質量的藜麥全基因組序列。藜麥全基因組序列的測序完成為分子標記的開發、基因定位和基因功能等提供了極有利的條件。本研究基于前人研究的基礎對藜麥SSR的多態性信息及分布位置進行進一步研究。

作物品種鑒定是農業生產環節必不可少的關鍵步驟，是保證品種優良遺傳性狀能夠充分發揮的重要舉措，也是名優品種保護、防止種子混雜退化的有效手段。DNA指紋圖譜技術具有豐富的多態性和顯著的個體特異性，能夠在分子水平上識別品種間的差異，不易受外界環境影響，可快速、準確地完成品種鑒定。隨藜麥種植面積的逐年擴大，對品種鑒定的需求也在增加，因此開展藜麥品種的鑒定是必需的。隨分子生物學的發展，分子鑒定逐漸用于已知品種庫維護和近似品種篩選工作中。SSR標記在單個位點上多態性高，技術成熟且利于推廣應用，因此作為構建DNA指紋數據庫的首選標記。目前，SSR標記已成功應用在亞麻、棉花、小麥、玉米、水稻、藕蓮等作物指紋圖譜構建上，但目前在藜麥品種鑒定中尚未見研究。

本研究利用SSR分子標記的方法對48份藜麥種質資源進行遺傳多樣性分析并構建DNA指紋圖譜，確定藜麥種質資源的遺傳基礎和遺傳多樣性，為藜麥遺傳育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗收集國內外藜麥種質資源共計48份，其中LM-BZ-47為青海西寧野生種。所有48份藜麥種質資源均由青海省農林科學院作物育種栽培研究所提供，種質資源編號和來源信息見表1。

表1 48份藜麥種質資源編號及來源

1.2 DNA提取

藜麥于2020年3月在青海省農林科學院試驗基地種植，海拔2 309 m左右，年均氣溫6 ℃左右，年均降水量約為380 mm。在藜麥苗期，選取5株長相一致的植株，等量混合葉片，利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取植物總DNA，檢測DNA質量及濃度，稀釋到50 ng/μL，-20 ℃保存備用。

1.3 引物來源及PCR檢測

引物(表2)一部分來源于Jarvis公布的已知引物，一部分根據Jarvis公布的藜麥基因組測序結果開發新的SSR分子標記，用于PCR擴增。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR擴增體系：DNA 2 μL，10×Buffer 1 μL，2.5 mmol/L each的dNTPs 0.8 μL，5 U/μL的E 0.2 μL，Primer-F 0.5 μL，Primer-R 0.5 μL，ddHO 5 μL，總體積10 μL。反應程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃(每個循環降低0.5 ℃) 45 s，72 ℃ 45 s，10個循環；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個循環；72 ℃ 5 min，10 ℃保存。PCR結束后在擴增產物中加入適量的 Loading Buffer，進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結束后將膠塊銀染顯色、拍照并讀帶。

將特異片段利用San-Prep柱式DNA膠回收試劑盒[購自生工生物工程(上海)股份有限公司]回收，與pMD18-T Vector[購自寶生物工程(大連)有限公司]連接、轉入DH5 α大腸桿菌感受態細胞[購自天根生化科技(北京)有限公司]并送往生工生物(上海)股份有限公司進行測序。隨后與Jarvis公布的基因組進行比對。

1.4 數據處理

根據PCR擴增結果，對將同一引物擴增出的大小相同的目的條帶視為1個等位變異，并進行記錄。有條帶的記為1，無條帶的或無法辨別的帶型記為0，構建[0，1]矩陣。利用Popgene 32軟件計算Nei’s的基因多樣性指數()、Shannon信息指數()、擴增總條帶數等遺傳參數。使用 PIC_calc 0.6 軟件計算各引物位點的多態信息含量(PIC)。利用DPS軟件UPGMA方法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 引物篩選與驗證

利用地理來源遠、形態差異較大的6份藜麥種質資源對收集和開發的SSR引物進行PCR擴增，并對擴增產物進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，淘汰不具多態性或多態性差的引物，最終篩選出25對條帶清晰、多態性較高、擴增穩定的SSR引物(表2)。利用這25對SSR引物在48個藜麥種質資源中擴增(圖1)。

表2 引物篩選結果

KAAT007(AAT)30AGGTACAGGCGCAAGGATACCGGTAGCATAGCACAGAACGKAAT018(ATT)11GCACCAACCTGAGTCCTAGCCGTGTCGCTGCTCATATTGTKAAT037(TAA)19TCAACCTCCGAATCCTATCAAGGATGCTGATTGGTGGATA-AAKAAT041(ATT)13AG(TAT)4TAG(TAT)5TG(TTA)5TGGGACTTCCATAAGGCAACATATTGCATGTCGAGCACCAKAAT043(AAT)24GGCTCCCACTAATTTCTTGTGTCATGCGGCTTGAGTAGTTTKCAA015(GTT)7TGGTTGGAGGCAAACATACCTGAGGGTGAAGAGGAGGATGKCAA078(CAA)3AAA(CAA)9AGGCGAGGATAACATGATCGAAGAAGCCATACCTCCCTCACKGA010(TC)11TGTTTCCTGCGTCCCTATTCGCTGAAGGTGAAATAGGTG-GAKGA145(AG)12CCAGGGTGAATCAGGGAATACTGGCAGGTGGGTCTTCTATBGA200(GA)20ACCAGCCACTTTGTCATTAGGGCCATGGTTGATGAATGAGA

2.2 遺傳多樣性分析

對篩選出的具有多態性的引物進行統計，見表3。25對引物共擴增多態性條帶134條，其中每對引物等位基因數位于3～13之間，平均值為5；其中KAAT007的等位基因較多，為13個，CQ5、CQ6、CQ15、CQ27、CQ4-10、CQ9-3、CQ11-2、KCAA015和KGA010等位基因最少，僅3個。多態性信息含量()介于0.378 8～0.852 2，均值為0.604 2，僅CQ15、CQ27、CQ9-3、KGA010和BGA200的小于0.5，說明絕大部分引物多態性信息良好。

通過挖膠測序并與藜麥基因組比對后發現，25對引物較為均勻地分布在15條藜麥染色體上(表3)，除6號和12號染色體無引物外，其余染色體至少1對引物，這為篩選出的25對分子標記的使用提供了更加完善的信息。遺傳多樣性分析表明，Nei’s基因多樣性指數()為0.107 5～0.368 7，均值為0.242 4。Shannon信息指數() 為0.204 3～0.551 6，均值為0.383 3。表明48份藜麥種質資源遺傳多樣性豐富。

表3 多態性引物信息

KAAT00180.163 40.284 20.779 52KAAT007130.107 50.204 30.852 214KAAT01870.187 30.314 20.716 817KAAT03790.143 00.245 90.721 713KAAT04170.160 30.282 50.762 85KAAT043100.142 00.252 80.812 27KCAA01530.341 20.517 50.519 311KCAA07860.185 80.298 80.543 45KGA01030.296 40.452 70.423 010KGA14550.304 00.464 10.686 710BGA20050.167 00.262 80.410 33均值50.242 40.383 30.604 2最大值130.368 70.551 60.852 2最小值30.107 50.204 30.378 8

2.3 聚類分析

利用25對引物的134條條帶對48份藜麥種質資源進行聚類分析，結果見圖2。由圖2可知，在遺傳相似系數0.706處，48份藜麥種質資源可聚為4個組。第Ⅰ組包括19份藜麥種質資源，主要是來自于青海和甘肅的藜麥種質資源，青海與甘肅地理環境相鄰，藜麥種質資源的遺傳背景也表現得較為相似；第Ⅱ組包括19份種質資源，主要是青海和阿根廷藜麥種質資源，青海與阿根廷藜麥生態條件相近，所種植的藜麥種質資源的遺傳背景也較為相似；第Ⅲ組包括9個種質資源，除LM-BZ-46外，其余均為阿根廷藜麥，表現為遺傳背景相似；第Ⅳ組包括1個種質資源，LM-BZ-47，為青海野生種質資源，與其他種質資源遺傳背景差異較大。

2.4 指紋圖譜構建

在25對多態性引物中，CQ135、CQ143、KAAT001、KAAT007、KAAT018、KAAT037、KAAT041、KAAT043的多態性指數較高，且均能鑒定出多個藜麥種質資源，可用來構建藜麥指紋圖譜。基于快速、經濟的檢測要求，對引物進行組合設計。根據利用最少引物鑒定最多品種的指紋圖譜構建原則，48份藜麥種質資源通過3對SSR引物組合即可完全被區分開，即KAAT001、KAAT007、KAAT043引物組合。對每對引物所擴增的條帶進行統計，得到每個品種的DNA指紋圖譜數據庫(表4)。

表4 48份藜麥種質資源SSR數字指紋圖譜構建

LM-BZ-160000010000000000001000010001000LM-BZ-400000001000010000000000000000100LM-BZ-170001000000000001000000000010000LM-BZ-410000100110000000000000001000000LM-BZ-180000100000000001000000000010000LM-BZ-420000100101101000000000001000100LM-BZ-190001100010000000001000000000010LM-BZ-430000001100000100000010100000000LM-BZ-200001000000000000000100110000010LM-BZ-440010000010000000000000101000000LM-BZ-210001000000000000000100110000000LM-BZ-450000100000000000010000010000000LM-BZ-220010010000000000001000110000000LM-BZ-460000000100000000001000000100000LM-BZ-230001000000000000100110110000000LM-BZ-470010100000000000000000011000100LM-BZ-240000100000000010000000010000100LM-BZ-480100010000000000001000011000000

3 討論與結論

藜麥引入國內時間較短，研究基礎薄弱、品種來源與遺傳背景不明，不利于藜麥新品種選育與開發。藜麥品種間遺傳差異的研究對于藜麥遺傳改良具有重要意義。SSR分子標記被廣泛地用于作物遺傳多樣性研究。一般認為，當<0.25 時，引物的多態性信息較低；當>0.50 時，引物的多態性信息較高。陸敏佳等從54對SSR引物中篩選出16對能明顯擴增出穩定的多態性條帶的引物，變幅為0.208～0.432，平均為0.366。孫夢涵等利用66對SSR標記在166份種質材料中檢測到327個等位位點，平均多態性信息含量為0.524，但是多態性信息含量均較少。本研究利用25對SSR引物對48份藜麥種質資源進行遺傳多樣性分析，介于0.378 8～0.852 2，均值為0.604 2，說明絕大部分引物多態性信息良好，且本研究通過測序明確每對引物在藜麥染色體上的位置，為藜麥種質資源的鑒定和研究提供更加完善的信息。聚類分析將48份藜麥種質資源聚為4個組。第Ⅰ組19份種質資源，第Ⅱ組19份種質資源，第Ⅲ組9份種質資源，第Ⅳ組1份青海野生藜麥種質資源。聚類分析結果與藜麥種質資源的來源、地理分布等信息大體相似，少部分聚類結果與農藝性狀表現有差異，這可能與所選分子標記的數量較少等原因有關，后續還需增加分子標記的數目。同時，聚類分析結果對于藜麥育種中材料的選擇有一定的指導和借鑒作用。

SSR標記已經成功應用于多個作物的指紋圖譜構建。潘根等利用SSR引物對24份來源于中國的亞麻品種進行DNA指紋數據庫構建；胡文斌等利用引物-帶型組合法，選取9對SSR引物構建了58個火龍果品種的指紋圖譜，為品種鑒定提供依據。在藜麥研究方面，SSR技術多用于遺傳多樣性分析，而用于藜麥指紋圖譜構建的則鮮有研究。本研究利用聚丙烯酰胺凝膠電泳首先篩選SSR引物，然后再進行重復性和穩定性檢測，具有易操作、成本低的特點，為藜麥種質分類、品種鑒定和品種權保護提供重要的理論依據與技術支撐。