黔西南不同程度石漠化土壤養分及微生物特征

楊 丹， 楊 智， 朱光旭， 文雙喜， 李 冕

(貴陽學院生物與環境工程學院，貴州貴陽 550005)

石漠化是指喀斯特地區由于脆弱的地質環境條件及人類活動的干擾，水土流失嚴重，導致土壤損失和地表植被減少，地表基巖裸露，呈現出類似荒漠化的土地退化現象。根據植被覆蓋度、基巖裸露度等，石漠化等級通常分為輕度、中度、重度。石漠化程度越高，土壤流失越嚴重，植物生長及生物量積累受抑制程度越高，植物數量、種類及植被覆蓋度越低。石漠化也導致土壤微生物發生顯著變化，隨石漠化等級提高，土壤細菌多樣性逐漸降低，真菌數量及其生物多樣性在不同等級石漠化土壤中差異顯著。石漠化導致土壤資源減少及有機質、氮、磷、鉀等養分含量降低，土壤質量惡化，土地生產力下降，嚴重影響當地農業生產，阻礙社會經濟的可持續發展。因此，喀斯特地區石漠化治理受到各級政府相關部門和學術界的高度重視。

貴州省是喀斯特地貌較集中地區，也是我國石漠化最嚴重的省份之一，石漠化的治理是當地社會經濟建設的迫切需要，而土壤質量調查與評估是開展石漠化治理的首要工作。土壤微生物數量及組成不僅反映了土壤質量的變化，也體現土壤生物活性，土壤微生物群落的豐度和結構變化特征可反映土壤質量的變化情況。土壤微生物生物量碳、氮含量的高低是衡量土壤肥力的重要指標，可指示土壤質量與退化程度；細菌、真菌、放線菌是土壤微生物的主要類群，研究其數量對石漠化治理過程中掌握土壤質量狀況具有重要意義。

目前，針對喀斯特石漠化地區土壤質量的相關研究主要集中在石漠化成因分析、石漠化地區土壤理化性質及植物多樣性、石漠化治理模式下的土壤理化性質及其相關性分析等，而對不同程度石漠化區土壤微生物特性的研究相對較少，尤其是針對不同程度石漠化土壤微生物生物量及微生物群落組成的研究鮮見報道。因此，本研究以貴州西南典型喀斯特地區不同等級石漠化土壤為研究對象，通過分析不同程度石漠化土壤養分特征、微生物生物量，細菌、真菌、放線菌的數量，以及細菌、真菌的群落組成，探討不同等級石漠化對土壤性質的影響，以期為石漠化治理過程中土壤質量改善措施的制定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于貴州省興仁市郊，該地常年平均氣溫約為15.2 ℃，年平均降水量為1 315 mm，平均海拔為 1 359 m，土壤類型主要為黃壤土，主要植被有馬尾松(Lamb.)為主的針葉林，零星分布的櫟子青岡() 、黃皮樹(Schneid.)、油桐()喬木林，以鐵線蓮()、忍冬(Thunb.)、刺梨()為主的藤刺灌叢，以及以牛蒡(L.)、青蒿()、狗牙根[(L.) Pers.]為主的草本植物。

1.2 樣品采集

參考熊康寧對喀斯特石漠化程度的分級標準，分別對代表輕度石漠化(LRD)、中度石漠化(MRD)、重度石漠化(SRD)程度的土壤進行采樣，選取未見明顯石漠化特征的土壤(NRD)為對照(表1)。每種等級選擇3個具有代表性的樣地，樣方面積約10 m×10 m，按照五點法采樣，每個樣方內采集的表層土壤樣品混合后以四分法取1 kg左右，共12個樣品。采樣時間為2017年8月，采樣深度為 0～20 cm。

表1 樣地基本信息[21]

1.3 樣品的處理與分析

采回的樣品去除石礫、根系后，一部分過2 mm篩后保存在4 ℃冰箱，用于測定微生物生物量碳含量、微生物生物量氮含量、細菌數量、真菌數量及群落結構分析，另一部分風干后用于養分含量測定。

采用氯仿熏蒸—重鉻酸鉀法測定微生物生物量碳含量，采用氯仿熏蒸—硫酸鉀提取—凱氏定氮法測定微生物生物量氮含量。土壤微生物數量采用培養基培養后計算菌落數：細菌采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基培養，真菌采用馬丁-孟加拉紅瓊脂培養基培養，放線菌采用改良高氏1號瓊脂培養基培養。微生物菌落數計算公式如下：

菌落數(CFU/g)=×÷。

式中：表示菌落平均數；表示稀釋倍數；表示烘干土壤質量。

土壤細菌群落結構分析采用Ezup柱式土壤基因組DNA試劑盒提取土壤總DNA，利用因美納(中國)科學器材有限公司MiSeq 2000測序儀進行高通量測序。

采用電位法測定樣品pH值；采用重鉻酸鉀法測定有機質含量；采用凱氏定氮法測定全氮含量；采用氫氧化鈉堿熔-鉬銻抗比色法測定全磷含量；采用氫氧化鈉堿熔-火焰光度法測定全鉀含量；采用堿解擴散法測定堿解氮含量；采用NaHCO浸提-鉬銻抗比色法測定速效磷含量；采用乙酸銨浸提-火焰光度法測定速效鉀含量。

1.4 數據處理

利用SPSS 22.0軟件對試驗結果進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，同時進行雙尾顯著性檢驗(=0.05)。

根據土壤總DNA測序結果，進行操作分類單元(OTU)聚類分析，利用BLAST軟件將OTU序列與對應數據庫比對，篩選OTU序列的最佳比對結果并進行過濾，將相似度大于90%且覆蓋率大于90%的序列進行分類；采用樸素貝葉斯算法對每條序列在屬水平上計算其分配到該層中的概率值，進行土壤細菌和真菌豐度分析。

2 結果與分析

2.1 不同石漠化程度土壤養分含量

由圖1可知，石漠化土壤pH值顯著高于無石漠化的土壤(NRD)，從輕度石漠化到重度石漠化，pH值增加了4.46%～5.50%。與對照土壤相比，土壤有機碳含量隨著石漠化程度的增加而顯著增加，為對照土壤的2.02～3.99倍。中度、重度石漠化土壤的全氮含量分別是無石漠化土壤的1.22、1.25倍。土壤全磷和全鉀含量在中度和重度石漠化土壤中則低于輕度和無石漠化土壤，中度和重度石漠化土壤中全磷含量分別比無石漠化土壤低33.33%、46.67%，全鉀含量分別比無石漠化土壤低5.83%、9.22%。重度石漠化土壤中速效磷的含量較無石漠化土壤相比，降低了25.81%。石漠化土壤中堿解氮、速效鉀含量均高于無石漠化土壤。

2.2 不同石漠化程度對土壤微生物生物量碳、氮及土壤養分含量的影響

由表2可知，無石漠化和輕度石漠化土壤的土壤微生物生物量碳含量(MBC)和微生物生物量氮含量(MBN)差異不顯著，在中度和重度石漠化土壤中明顯降低。與對照土壤相比，中度、重度石漠化土壤中MBC分別降低了18.53%、31.10%，MBN分別降低了21.67%、33.93%。隨著石漠化程度的加重，土壤微生物生物量碳含量與總有機碳含量比值(MBC/TOC)顯著降低，從輕度到重度石漠化土壤，MBC/TOC降低了48.92%～82.26%。相關性分析結果(表3)表明，MBC和MBN均與土壤有機質含量和全氮含量呈極顯著負相關關系，MBC/TOC與土壤pH值、有機質含量和全氮含量呈極顯著負相關關系，MBN與MBC、MBC/TOC分別呈極顯著、顯著正相關關系。

表2 不同石漠化程度土壤MBC、MBN含量及MBC/TOC

2.3 不同石漠化程度土壤微生物數量及與土壤養分含量的相關性

由表4可知，不同等級石漠化土壤中微生物數量差異明顯，土壤微生物數量占微生物的比例略有不同。輕度、中度石漠化土壤中，細菌數量最多，其次是放線菌，真菌數量最少。重度石漠化土壤中，細菌數量最多，放線菌數量最少。隨著石漠化等級的提高，土壤細菌、真菌、放線菌數量均顯著下降。從輕度到重度石漠化土壤，細菌數量降幅為36.11%～90.63%，放線菌的降幅為26.38%～93.62%，真菌的降幅為72.59%～89.85%。相關性分析結果(表3)表明，細菌、真菌、放線菌數量均與土壤pH值、有機質、全氮呈顯著或極顯著負相關關系。細菌數量與全磷含量、堿解氮含量、速效磷含量、MBC、MBN呈顯著正相關關系，與MBC/TOC呈極顯著正相關關系；真菌數量與全磷含量、MBC、MBN及MBC/TOC呈顯著正相關關系；放線菌數量則與MBC、MBN及MBC/TOC呈顯著正相關關系。

表4 不同石漠化程度土壤微生物數量

2.4 不同石漠化程度土壤微生物群落組成

由圖2可知，4個土壤樣本的細菌分屬于2 884個屬，優勢菌群主要為微球菌科(Micrococcaceae)、酸桿菌綱(Acidobacteria)、酸微菌科(Acidimicrobiaceae)、芽單胞菌(Gemmatimonadaceae)和Gaiellales。無石漠化土壤中細菌種類最多，其次為輕度石漠化土壤，中度、重度石漠化土壤中細菌種類明顯較低，其中中度石漠化土壤中細菌菌屬最少。輕度石漠化土壤與無石漠化土壤樣本間豐度存在顯著差異的菌屬為42個，中度石漠化土壤與無石漠化土壤樣本間豐度存在顯著差異的菌屬為52個，重度石漠化土壤與無石漠化土壤樣本間豐度存在顯著差異的菌屬為175個。

由圖3可知，4個土壤樣本中有25.5%～35.5%的細菌群落為未知菌群。無石漠化土壤中Gaiellales目未明確屬和鞘脂單胞菌屬()豐度顯著高于3種石漠化土壤，但輕度、中度和重度石漠化土壤中微球菌(Micrococcaceae)的豐度為9.4%～10.4%，顯著高于無石漠化土壤(豐度僅0.9%)。類諾卡氏菌()僅在無石漠化土壤中檢測到。玫瑰彎菌菌屬()僅在輕度石漠化、重度石漠化和重度石漠化土壤中檢測到，而在無石漠化土壤中未檢測到；藍藻綱未明確屬(norank_c_Cyanobacteria)只在重度石漠化土壤中檢測到。

由圖4可知，不同石漠化程度土壤樣本的真菌分屬于2 059個屬，其中無石漠化土壤中真菌種類最多，其次為輕度石漠化土壤，中度石漠化土壤和重度石漠化土壤中真菌種類較低，其中中度石漠化土壤中真菌菌屬最少。輕度石漠化土壤與無石漠化土壤樣本間豐度存在顯著差異的菌屬為77個，中度石漠化土壤與無石漠化土壤樣本間豐度存在顯著差異的菌屬為70個，重度石漠化土壤與無石漠化土壤樣本間豐度存在顯著差異的菌屬為98個。

由圖5可知，4個土壤樣本中有4.6%～25.1%的真菌群落為未知菌屬，隨石漠化程度的增加，未知菌屬的豐度降低，主要優勢真菌有子囊菌門(Ascomycota)、毛殼菌科(Chaetomiaceae)、鐮刀霉菌(Fusarium)、被孢霉屬(Mortierlla)等。無石漠化土壤中毛殼菌()豐度顯著高于3種石漠化土壤。無石漠化土壤、輕度石漠化土壤和中度石漠化土壤中被孢霉屬的豐度顯著高于重度石漠化土壤，但重度石漠化土壤中子囊菌門的真菌群落豐度顯著高于其他土壤。隨著石漠化程度的增加，鐮刀菌屬的豐度呈降低趨勢。鏈囊芽枝菌科(Catenariaceae)、壺菌綱(Chytridiomycetes)和僅在無石漠化土壤中檢測到。漆斑菌()僅在輕度石漠化、重度石漠化和重度石漠化土壤中檢測到，在無石漠化土壤中未檢測到。中度和重度石漠化土壤中還檢測到糞殼菌目(Sordariomycetes)和。此外，柱銹耳屬()只在重度石漠化土壤中檢測到。

3 討論與結論

3.1 不同石漠化程度土壤養分含量

本研究前期試驗結果表明，石漠化土壤pH值顯著高于無明顯石漠化特征的土壤，相關研究表明，pH值可能是預示土壤發生石漠化的一個指標。Qi等在調查石漠化土壤細菌多樣性的研究中同樣發現， 無論是輕度、中度、還是重度石漠化的土壤，其pH值均顯著高于未發生石漠化的土壤，可能是由于石漠化過程中發生土壤侵蝕及石灰巖溶解，增加了土壤溶液中OH濃度。石漠化土壤有機質含量顯著增加的原因可能跟石漠化地區石灰巖的溶解有關，溶解程度越大，分解出的有機質越多。因此，在石漠化地區，有機質含量可能不是反映土壤質量的指標。中度和重度石漠化土壤全氮含量顯著高于輕度、未石漠化的土壤，這可能是由于輕度和未發生石漠化土壤上生長的植物較多，吸收了土壤中的氮；而中度和重度石漠化土壤植被覆蓋率低，被植物吸收的養分相對較少，土壤微生物種類和數量也相對較少，因而積累了相對較多的有機質和氮。隋夕然等的研究也發現，重度石漠化土壤團聚體有機碳及全氮含量高于潛在石漠化土壤。

盛茂銀等認為，隨著石漠化程度的加重，裸露的巖石聚集效應顯著，大氣沉降匯集的養分和巖溶產物，增加了土壤有機質和氮素的輸入，且隨石漠化程度的增加，可流失的土壤減少，養分流失也相應減少。本研究中，土壤全磷和全鉀含量在中度、重度石漠化土壤中低于輕度、未發生石漠化的土壤，在重度石漠化土壤中速效磷的含量也較低，說明石漠化程度越高，養分限制越明顯。

3.2 不同石漠化程度土壤微生物生物量及與土壤養分含量的相關性

土壤微生物生物量是土壤有機質的活性部分，是土壤中易于利用的養分庫及有機物分解和礦化的動力，能夠敏感地反映土壤質量狀況。土壤微生物生物量碳含量約占土壤總有機碳含量的1%～4%，是促使土壤有機物及養分轉化的動力，其含量表征著土壤活性有機碳的儲量。土壤微生物生物量氮含量的變化對土壤氮循環起著重要作用。中度、重度石漠化土壤中土壤微生物生物量碳(MBC)和生物量氮(MBN)含量顯著低于無明顯、輕度石漠化土壤，且隨著石漠化程度的加深，土壤微生物生物量碳與有機碳比值(MBC/TOC)顯著下降，說明土壤活性養分供應受到影響，土壤質量下降明顯。

許多研究表明，土壤MBC和MBN與土壤養分狀況具有較好的相關性。土壤微生物通過分解有機質獲得維持生長及代謝所需的養分和能量，因此MBC與土壤總有機碳含量之間存在顯著的正相關關系。本研究中MBC和MBN均與土壤有機質和全氮含量呈負相關關系，MBC/TOC與土壤pH值、有機質含量和全氮含量呈負相關關系，說明雖然中度及重度石漠化區土壤有機質含量和全氮含量較高，但其活性養分含量低；因此，有機質和全氮含量越高并不意味著土壤肥力越好。

3.3 不同石漠化程度微生物數量及與土壤養分含量的相關性

土壤微生物數量，影響著土壤養分組成、轉化，以及土壤透氣透水性，同時也反映土壤生物活性。微生物數量的變化能夠敏感地反映土壤質量，與土壤物理性質、養分含量等密切相關。本研究發現，隨著石漠化等級的提高，土壤細菌、真菌、放線菌數量均存在顯著下降，說明土壤質量顯著降低。從微生物組成上看，不同等級石漠化土壤中細菌數量最多，可見對土壤生物活性起主要作用的是細菌，對于分解有機物質、提高土壤養分有效性具有重要作用。相關研究發現，不同等級石漠化土壤細菌數量及多樣性隨石漠化程度的增加而降低；土壤真菌多樣性及豐富度在不同石漠化程度土壤中差異顯著。本研究中微生物數量變化規律與上述研究一致。

本研究中細菌、真菌、放線菌數量均與土壤pH值、有機質、全氮含量呈顯著負相關關系。原因可能跟研究區中度和重度石漠化土壤中的有機質和全氮含量較高有關，由于石漠化過程中石灰巖的不斷溶解，釋放出的有機質較多；中度和重度石漠化區植被覆蓋率低，被植物吸收的養分相對較少，而微生物種類和數量也相對較少，因而積累了相對較多的有機質和氮。相關性分析還表明，細菌數量與全磷、堿解氮、速效磷含量和MBC、MBN呈顯著正相關關系，與MBC/TOC呈極顯著正相關關系；真菌數量與總磷、MBC、MBN及MBC/TOC呈顯著正相關關系；放線菌數量則與MBC、MBN及MBC/TOC呈顯著正相關關系，與文小琴等的研究結果一致。

3.4 不同石漠化程度對土壤微生物群落組成的影響

無石漠化土壤中細菌和真菌種類最多，其次為輕度石漠化土壤，中度石漠化土壤和重度石漠化土壤中細菌和真菌種類顯著較低。表明石漠化會顯著降低土壤中細菌、真菌的種類，中度石漠化土壤中細菌和真菌種數最少，說明中度石漠化是喀斯特土壤環境的不穩定階段，這與Qi等的研究結果類似。本研究中，4種土壤樣本的優勢細菌群主要為微球菌、酸桿菌、酸微菌、芽單胞菌和Gaiellales，主要優勢真菌群有子囊菌、毛殼菌、鐮刀霉菌和被孢霉屬等。曹成亮等的研究發現，藍細菌門(Cyanobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)等為石漠化生境中的優勢細菌群。唐源等對貴州喀斯特石漠化生境細菌多樣性的研究表明，藍細菌門、變形菌門和放線菌門是優勢細菌類群，子囊菌門是優勢真菌類群。唐婧等在貴州喀斯特土壤微生物多樣性研究中發現，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門等是主要的優勢細菌門，鞘脂單胞菌屬、和乳桿菌屬()的豐度最高；子囊菌門、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)等是主要的優勢真菌門，其中子囊菌門豐度最高，鐮刀菌屬()、枝孢菌屬()、尾柄孢殼菌屬()等的豐度也較高，同時發現土壤微生物群落豐度與土壤pH值顯著相關。李選文等在對云南石林地區石漠化可培養細菌的多樣性研究中發現，假單胞菌屬()、節桿菌屬()和不動桿菌屬()的相對分離率較高，可能為優勢菌群。這些研究結果說明，不同地區石漠化生境微生物在群落結構方面，既有一定的相似性，又有一定的差異性。

雖然石漠化土壤與無石漠化土壤中優勢菌群的種類一致，但在菌群組成和豐度上存在顯著差異。細菌群落分析結果表明，無石漠化土壤中菌屬和鞘脂單胞菌屬豐度顯著高于3種石漠化土壤，但輕度、中度和重度石漠化土壤中微球菌的豐度為顯著高于無石漠化土壤。真菌群落分析結果表明，無石漠化土壤中毛殼菌的菌落豐度顯著高于3種石漠化土壤。無石漠化土壤、輕度石漠化土壤和中度石漠化土壤中被孢霉菌屬的豐度顯著高于重度石漠化土壤，但重度石漠化土壤中子囊菌門的真菌群落豐度顯著高于其他土壤。隨著石漠化程度的增加，鐮刀菌屬的豐度呈降低趨勢。說明石漠化程度的加深影響了這些菌落生長。Qi等研究表明，石漠化會影響細菌的豐度；Wang等研究也表明，石漠化會影響真菌的豐度，引起土壤微生物群落結構的變化。

細菌群落組成分析表明，玫瑰彎菌屬僅在輕度石漠化、中度石漠化和重度石漠化土壤中檢測到，而在無石漠化土壤中未檢測到；藍藻綱未明確屬只在重度石漠化土壤中檢測到。真菌群落組成分析表明，漆斑菌僅在輕度石漠化、重度石漠化和重度石漠化土壤中檢測到；中度和重度石漠化土壤中還檢測到糞殼菌和；此外，柱銹耳屬只在重度石漠化土壤中檢測到。這一研究結果提示，石漠化程度會影響細菌、真菌總量及其群落多樣性，原因可能是玫瑰彎菌屬和漆斑菌能夠適應各種石漠化土壤環境，糞殼菌和能夠適應中度和重度石漠化土壤環境，而藍藻綱未明確屬和柱銹耳菌能夠適應重度石漠化生境。當然，土壤養分也會影響土壤微生物的生長。

在石漠化土壤中未檢測到某些菌群，如各類石漠化土壤中未檢測到類諾卡氏菌、鏈枝菌、壺菌和等，輕度石漠化土壤中未檢測到藍藻綱未明確屬、糞殼菌、，中度石漠化土壤中未檢測到藍藻綱未明確屬，重度石漠化土壤中未檢測到溶桿菌()等。同時，一些種類的細菌和真菌群落豐度在不同石漠化程度的土壤中存在顯著差異，如輕度石漠化土壤中豐度最高，而在重度石漠化土壤中豐度最低，但漆斑菌的豐度在輕度石漠化土壤中最低，而在重度石漠化土壤中豐度最高。說明不同種類的細菌對石漠化的敏感性不同，石漠化在抑制一些種類細菌生長的同時，也可能促進另一些種類細菌的生長，石漠化程度對土壤細菌和真菌群落多樣性的影響存在顯著差異。Qi等的研究發現，隨著石漠化程度的加重，變形菌的豐度增加，而藍細菌的豐度降低。

因此，在石漠化地區，土壤中有機質和全氮含量高，并不能說明土壤養分含量高，原因可能跟石灰巖的溶解與植被生長量有關；石漠化土壤中細菌、真菌種類顯著降低；隨石漠化程度加重，土壤微生物生物量碳、土壤微生物生物量氮含量和細菌、真菌、放線菌數量均顯著下降，土壤微生物生物量、微生物數量與土壤養分之間具有較強的相關性。土壤微生物生物量、微生物數量及群落組成可用來表征石漠化土壤質量。