NLRP3位點rs12048215多態(tài)性對哮喘兒童外周血嗜酸粒細胞的影響

蔡旭龍 尹同進 徐巧嵐

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是兒童常見的慢性呼吸道疾病，目前發(fā)病機制尚不明確，主要由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用引起，其病理特點為慢性氣道炎癥[1]。研究發(fā)現哮喘主要由Th2細胞因子IL-4、IL-5和IL-13驅動，導致氣道嗜酸性粒細胞炎癥[2]。NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor containing pyrin domain 3，NLRP3)是模式識別受體家族NOD樣受體中的一員，參與Th2細胞的分化[3]。NLRP3是組成NLRP3炎癥小體的重要部分，使哮喘兒童外周血中，下游因子IL-1β和IL-18水平升高，與哮喘疾病進程關系密切[4]。目前，NLRP3基因多態(tài)性是否影響哮喘的易感性及其表型的研究鮮有報道。本研究分析NLRP3基因位點多態(tài)性在哮喘患兒和健康兒童中的分布差異，探討基因多態(tài)性在哮喘發(fā)病中的意義。

資料與方法

一、研究對象

2020年8月至2021年6月期間在鹽城市第三人民醫(yī)院就診治療的哮喘兒童，收集急性發(fā)作期的患兒130例，其中女性57例，男性73例，年齡3～14歲，診斷哮喘符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[5]。同期收集80例健康兒童，其中女性36例，男性44例，年齡3～14歲，無哮喘、過敏性鼻炎、特應性皮炎史，無遺傳免疫缺陷病史，無過敏史，家族中三代以內無哮喘史。與納入研究兒童家長簽訂知情同意書，同時本次研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(批準文號：2020-55)。

二、標本采集及DNA提取

空腹抽取外周靜脈血2mL于EDTA抗凝管中。DNA的提取嚴格按照人血DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)說明操作。提取的DNA標本存放-80℃冰箱。

三、基因目標位點篩選

從“千人基因組計劃”項目數據庫中下載中國漢族健康人群NLRP3基因多態(tài)性位點數據(http://grch37.ensembl.org/index.html)。將獲得的數據導入Haploview，設計分析的最小等位基因頻率大于20%，依據連鎖不平衡獲得5個Block區(qū)，每個區(qū)篩選1個位點，共5個目標位點(rs12137901、rs4998423、rs12048215、rs1539019、rs12130711)(見表1)。

表1 NLRP3多態(tài)性位點在不同block區(qū)分布情況

四、多重擴增及高通量測序基因分型

設計并合成好一個包含5個SNP位點的引物池(見表2)，然后通過兩步PCR的方法完成目標SNP位點的擴增和兼容illumina測序文庫的制備。第一輪PCR體系如下：DNA模板(10 ng/μL)2μL；上游引物池(10μM)1μL；下游引物池(10μM)1μL；2×PCR Ready Mix 15μl (總體積 25μL)(Kapa HiFi Ready Mix)。配制好反應體系后，在PCR儀(BIO-RAD，T100TM)執(zhí)行反應程序：98℃預變性3分鐘，然后執(zhí)行8個循環(huán)(條件：98℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒)。緊接著執(zhí)行25個循環(huán)(條件：98℃變性30秒，66℃退火30秒，72℃延伸30秒)。最后72℃延伸5分鐘。反應完成后，維持4℃。

表2 NLRP3多態(tài)性位點的引物

然后以第一輪PCR產物為模板執(zhí)行第二輪PCR反應，以獲得測序帶分子標簽的文庫。反應體系如下：DNA模板(10ng/μL)2μL，通用P7引物(含分子標簽，10μM)1μL; 通用P5引物(10μM)1μL; 2×PCR Ready Mix15μL (總體積30μL)。配制好反應體系后，執(zhí)行如下PCR程序：98℃預變性5分鐘，然后執(zhí)行5個循環(huán)程序(變性94℃30秒，55℃退火20秒，72℃延伸30秒)。最終72℃延伸5分鐘。完成后維持4℃。最終PCR產物使用AMPure XP磁珠純化回收。各個PCR產物等量混合后，使用HiSeq XTen測序儀(Illumina, San Diego, CA)進行測序。

使用BWA(v 0.7.13-r1126)軟件將質控合格的序列比對到參考基因組上，參數為默認參數。根據比對結果，通過samtools軟件(版本0.1.18)計算目標位點的基因型結果基因分型。

五、統(tǒng)計學方法

結 果

一、研究對象的一般特征

本次研究納入哮喘兒童130例，健康兒童80例，通過病例對照研究進行分析。年齡、性別構成在兩組間無統(tǒng)計學差異。總IgE、白細胞、嗜酸粒細胞百分比在哮喘組中均明顯高于健康組，P<0.001。哮喘組中有過敏史的占60.7%，過敏性鼻炎占42.3%，特應性皮炎的占29.2%，有哮喘家族史的占18.4%(見表3)。

表3 研究對象一般資料

二、多態(tài)性位點基因型及等位基因在哮喘和健康兒童中的分布情況

通過Haploview分析獲得NLRP3基因Tag位點rs12137901、rs4998423、rs12048215、rs1539019、rs12130711，并進行基因分型(見表4)。5個多態(tài)性位點的基因型及等位基因在哮喘和健康兒童中分布無統(tǒng)計學差異。

表4 NLRP3基因位點多態(tài)性在哮喘和健康兒童中的分布[n(%)]

三、不同基因型在嗜酸粒細胞表型中的分布情況

取嗜酸粒細胞比例3%為分界，將哮喘兒童分兩組：嗜酸粒細胞%>3%(n1=63)，嗜酸粒細胞%≤3%(n2=67)，并進行基因型分布統(tǒng)計分析(見表5)。rs12048215位點有AA、AG、GG三種基因型。嗜酸粒細胞%>3%組中構成比為AA(60.3%)、AG(33.3%)、GG(6.4%)。嗜酸粒細胞%≤3%組中構成比為AA(38.8%)、AG(53.7%)、GG(7.5%)。rs12048215位點基因型在兩組不同比例嗜酸粒細胞中分布有差異，P=0.045。共顯性模型AA vs (AG+GG)在兩組中的分布比較(P=0.014，OR [95%CI]=2.397[1.185～4.848])。rs12048215位點等位基因A、G在兩組中有統(tǒng)計學差異(P=0.044，OR [95%CI]=1.748[1.012～3.021])。

表5 NLRP3基因位點多態(tài)性在哮喘兒童不同嗜酸粒細胞比例中的分布[n(%)]

四、rs12048215位點多態(tài)性的功能預測

通過3DSNP v2.0預測NLRP3基因rs12048215位點的功能[6](見表6)。分析出rs12048215位點可能影響FOS和STAT3。FOS是AP-1轉錄因子的亞單位，存在于細胞核質內，參與調節(jié)嗜酸粒細胞[7]。STAT3是信號轉導和轉錄激活因子，存在于細胞核質和胞漿中，參與調節(jié)嗜酸粒細胞[8]。

表6 與rs12048215位點相關的蛋白因子

討 論

遺傳因素在哮喘發(fā)病中起著重要作用，遺傳率在35%到95%之間，研究確認存在數百種與哮喘風險增加相關的基因變異[9]。遺傳密碼翻譯方式的表觀遺傳變異也被證明在哮喘的發(fā)展中起作用[10]。目前對哮喘的理解涉及到大量的遺傳多樣性，這些遺傳多樣性通過表觀遺傳和轉錄因子進行可變的翻譯和環(huán)境影響，導致慢性氣道炎癥的組織病理學特征，從而表現出主要的哮喘癥狀[9]。

病原體和過敏原能夠活化NLRP3[11]。活化的NLRP3能夠募集PYCARD和Caspase-1，形成NLRP3炎癥小體，參與Th2細胞的分化及Th2類型的過敏炎癥反應[12-13]。一項在乳清蛋白誘導的過敏性氣道炎癥小鼠模型中的研究，發(fā)現NLRP3參與過敏性氣道炎癥的過程[14]。有研究證實NLRP3可通過上調IL-4的表達促進M2巨噬細胞極化[15]。因此，NLRP3參與哮喘的發(fā)病機制。但本次研究NLRP3的位點的多態(tài)性在哮喘組和健康兒童中分布無差異，可能不是哮喘易感性的因素。

富含嗜酸性粒細胞的慢性氣道炎癥是哮喘的一個重要特征[16]。嗜酸性粒細胞是由CD34+前體細胞產生的終末分化粒細胞。IL-5、CCR3和CD34與受體結合可促進前體細胞分化為嗜酸性粒細胞。基質細胞、肥大細胞和活化T細胞產生IL-5、GM-CSF和IL-3是骨髓中嗜酸性粒細胞生長和成熟的重要組成部分[17]。在哮喘病程進展過程中，嗜酸粒細胞引起氣道慢性炎癥發(fā)揮重要作用[18-19]。

有研究發(fā)現在NLRP3缺失的小鼠模型中，HDM誘導的過敏性肺部炎癥顯示出肺和肺泡灌洗液中嗜酸粒細胞明顯增加[20]，NLRP3的缺失對嗜酸粒細胞調節(jié)失控。本次研究中，NLRP3基因位點rs12048215的基因型AA、AG、GG在嗜酸粒細胞高比例組和低比例組中，分布有明顯差異。在哮喘兒童中，基因型AA與嗜酸粒細胞增高表型有相關性。通過基因位點功能的預測，rs12048215位點多態(tài)性與FOS和STAT3有關聯(lián)。而FOS和STAT3均能夠對嗜酸粒細胞產生影響。FOS和STAT3的表達可能受到rs12048215位點多態(tài)性的影響，進而可能影響嗜酸粒細胞表型。

NLRP3基因rs12048215位點多態(tài)性可能是哮喘兒童嗜酸粒細胞增高表型的因素。但本次研究的樣本量、基因位點偏少，需要更廣泛系統(tǒng)的研究證實位點多態(tài)性對哮喘表型的影響。