安陽市內黃縣花生果腐病病原種類鑒定及發生動態研究

蘆連勇，華福平，王 艷

（安陽市農業科學院，河南 安陽 455000）

花生是河南省的主要油料和經濟作物，播種面積僅次于小麥和玉米，花生是河南省第三大農作物。花生果腐病，俗稱爛果病，最早在美國發現，之后世界許多國家相繼報道，在我國山東、河北、吉林、河南等地發生，危害嚴重，尤其是重茬地塊，有逐年加重趨勢［1］。一般發病田產量損失達15%左右，重病田可致絕收。國內外研究表明，花生果腐病是由多種病原菌侵染引起的。病原菌包括絲核菌（Rhizoctoniasp.）、腐霉菌（Pythiumsp.）、冬青麗赤殼菌（Sclerotiumsp.，有性階段）、侵脈新赤殼菌（Neocosmosporasp.，有性階段）、鐮刀菌（Fusariumsp.）等［2］。不同地域和環境條件下病原菌種類存在較大差異，不同的病原菌引起花生果腐病的癥狀不同［2］。我國花生果腐病以真菌土傳病菌鐮刀菌侵染為主，腐霉菌次之。該病害主要危害果柄和莢果，罹病果表現出不同程度的褪色，從淺表變褐色到整個莢果殼完全變成黑色。不同發育階段的莢果均可受害，果仁也表現出不同程度的腐爛。果柄與莢果的結合部罹病后果柄與莢果結合不牢固，不利于機械化收獲，加大產量損失［1-2］。但是病原菌致病機制及花生抗病機制相關基礎研究進展緩慢，不同地域、不同環境下（土壤類型、溫度、濕度），花生果腐病原菌的侵染及致病力也存在很大差異。

安陽市內黃縣、滑縣是河南省花生主產區，花生常年種植面積在7 萬hm2左右，近年來隨著花生種植機械化水平和相對收益率的不斷提高，農民種植花生的積極性在不斷提高，種植面積也隨之增大。從2018 年開始，隨著安陽市花生種植面積的逐年擴大，花生果腐病有逐年蔓延流行發生的趨勢，目前已經成為安陽地區花生主產區的主要土傳病害之一。2020 年，內黃縣高堤鄉、二安鄉等地發生了花生果腐病，嚴重情況下，發病率高達50%以上，造成了大幅度減產。花生果腐病的防治比較困難，目前尚缺乏有效的治理措施。該病的發生不僅影響花生產量和品質，也影響農民種植積極性，對安陽地區花生產業發展構成了嚴重威脅。為了最大限度降低花生果腐病危害，實現防病增產，安陽市農業科學院花生團隊在承擔安陽市重點研發與推廣專項——高產、抗果腐病花生新種質創制與新品種選育任務基礎上，從2019 年開始連續3 a 對安陽市內黃縣的花生果腐病進行調查和取樣，對致病病原菌進行鑒定，同時對花生果腐病發生動態進行調查研究，為防治花生果腐病提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料采集

鑒定果腐病材料樣本均從內黃縣二安鎮、高堤鄉、井店鎮、城關鎮這幾個鄉鎮選取，種植品種為豫花37、濮花28、安花3 等品種。

1.2 病原菌分離鑒定

病原菌分離應用單孢分離法，并應用柯赫氏法則進行驗證。

1.2.1 病原菌分離 將患果腐病材料樣本用清水沖洗3 h，用無菌水浸泡沖洗5 次，放置于無菌濾紙吸干水分后，在染病與健康交界處帶果仁剪取4 mm×6 mm的染病組織。然后用次氯酸鈉消毒1 min，再用無菌水漂洗后，用無菌濾紙吸干水分，立即放置于瓊脂培養皿中，待菌絲自然長出后，切取菌絲尖端放置于馬鈴薯葡萄糖培養基，移放入25 ℃恒溫培養箱中培養6 d，保持光照12 h、黑暗12 h 條件，待菌落自然形成后，統計各菌落數，經分離純化后作為供試菌株。

1.2.2 病原菌鑒定 將分離純化后的供試菌株移植到馬鈴薯葡萄糖培養基上，放入25 ℃恒溫箱黑暗環境條件下培養，4 d 后供試菌株長出菌絲，在光照12 h、黑暗12 h 的條件下培養8 d，每天觀察記錄菌絲生長狀況和菌株的形態特征及分生孢子形態。利用十字交叉法測量菌落直徑。采用《真菌鑒定手冊》［3］中的方法進行鑒定，確定病原菌種類。

1.2.3 不同氮源條件下病原菌落生長直徑變化測定 利用相同量的硫酸銨、草酸銨、硝酸銨、酵母膏、花生餅、蛋白胨作為氮源，均以查彼克培養基為基礎對照，置于27 ℃恒溫箱培養6 d。采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.4 不同碳源條件下病原菌落生長直徑變化測定 利用相同量的葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖、乳糖、麥芽糖作為碳源，均以查彼克培養基為基礎對照，置于27 ℃恒溫箱培養6 d。采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.2.5 病原菌絲最高致死溫度測定 將6 個離心管中均盛入3 mL 滅菌水，然后每個離心管中均放入4枚4 mm 的菌絲塊，恒溫水浴箱分別設置50、55、60、65、70 ℃，共5 個溫度處理，加熱1 min 后，放入菌絲塊，再分別加熱5 min 和10 min 后，取出菌絲塊，移植到馬鈴薯葡萄糖培養基上，放入25 ℃恒溫箱培養6 d，調查菌絲死亡情況，確定菌絲最高死亡溫度。

1.2.6 病原菌落在不同pH 值下的生長直徑測定 馬鈴薯葡萄糖培養基用1.2 mol/L NaOH 無菌溶液和1.2 mol/L HCl 無菌溶液調節pH 值，分別將pH 值設為5～10，根據每個pH 值制作對應的馬鈴薯葡萄糖培養基平板，每個平板均接種7 mm 菌落塊，放入25 ℃恒溫箱黑暗環境條件下培養8 d。采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3 花生果腐病發生動態調查

2019—2021 年的5 月中上旬至9 月中上旬，連續3 a 在安陽市最具代表性的花生主產區內黃縣城關鎮陳營村、二安鎮李草坡村等8 個村開展花生果腐病發生動態調查。調查方法為隨機選取10 戶裸地花生種植地塊，采用單對角線式取樣法，每點取樣100 株，觀察記載病株數，計算病株率：病株率=病株數/調查總株數×100%。調查從出苗開始到收獲結束，調查周期為15 d。

花生果腐病病情指數調查方法為首先采用單對角線五點取樣法對花生果腐病病株進行調查，每點調查100 株，然后統計發病株數，根據發病株數進行病害分級。計算病情指數：病情指數=∑（各級病株數×各級代表值）/（調查總株數×最高級值）×100［4］。

1.4 數據分析

數據處理及統計分析采用Excel 2019 和SPSS 12.0 軟件進行。

2 結果與分析

2.1 病原菌種類鑒定

通過對內黃縣二安鎮、高堤鄉、井店鎮、城關鎮采集到的60 個果腐病典型病株純化分離病原菌，共得到195 個菌落。在顯微鏡下觀察，菌絲顏色呈灰白色至淡黃色，呈疏松狀；有2 種形態不同的分生孢子，大型分生孢子形狀為稍彎曲鐮刀形，有5 個左右隔膜；小型分生孢子形狀為卵圓形至長橢圓形，生長在分生孢子梗上，呈彎曲或直狀，有1 個隔膜或無隔膜。根據菌落形態特征鑒定出4 種不同的病原菌（表1）。由表1 可知，茄鐮刀病原菌占比71.8%，群結腐霉病原菌占比18.5%，曲霉病原菌占比1.0%，鏈格孢病原菌占比8.7%。

表1 病原菌種類鑒定結果 個

利用盆栽回接法培養病原菌，共出現16 個患病花生果殼樣品。分離物經過單孢純化后，利用孢子懸浮液分別接種到花生莢果和花生苗上，花生莢果有9 株出現與田間發病類似病癥，花生苗均未產生癥狀。在分離的病原菌中，茄鐮刀菌致病性最強，在接種發病的花生染病與健康交界處帶果仁剪取染病組織，分離純化病菌形態與接種菌株形態類似。病原菌培養結果顯示，茄鐮刀病原菌占81.6%，群結腐霉病原菌數占52.8%，曲霉病原菌占0%，鏈格孢病原菌數占4.8%。分離鑒定結果表明，安陽市內黃縣花生果腐病病原菌主要是茄鐮刀菌和群結腐霉菌。

2.2 不同氮源對病原菌落生長直徑的影響

病原菌菌落在不同氮源條件下生長直徑變化有明顯差異，其中菌落直徑最大的氮源為酵母膏，達到60 mm，其次為蛋白胨，菌落直徑長為57 mm，酵母膏和蛋白胨為最適宜菌絲生長氮源。草酸銨組的菌落生長直徑最小，為21 mm，其次是硫酸銨，菌落生長直徑為25 mm，草酸銨和硫酸銨為最不適宜菌絲生長氮源。除對照組外，菌絲生長旺盛，均能覆蓋培養基。對照組的菌絲生長直徑為52 mm，生長稀疏，菌絲不能覆蓋培養基（圖1）。

圖1 不同氮源對病原菌落生長的影響

2.3 不同碳源對病原菌落生長直徑的影響

病原菌菌落在不同碳源條件下生長直徑變化不明顯，菌落生長直徑最長的碳源為乳糖，達到69 mm，乳糖為最適宜碳源，其次為蔗糖，菌落生長直徑為65 mm，麥芽糖、葡萄糖、木糖組的菌落生長直徑分別為64、62、60 mm，果糖組菌落生長直徑最小，為58 mm。不同碳源對菌絲生長直徑影響較小，菌絲生長濃密，培養基被菌絲完全覆蓋。對照組菌落生長直徑為63 mm，菌絲生長稀疏，不能完全覆蓋培養基（圖2）。

圖2 不同碳源對病原菌落生長的影響

2.4 病原菌絲最高致死溫度

將病原菌菌絲分別在50、55、60、65 ℃處理5 min后，均能繼續生長，處理10 min 后，也能正常生長；在67 ℃5 min 后，停止生長。可見，致死條件為67 ℃5 min。

2.5 不同pH 值對病原菌落生長直徑的影響

pH 值為7 時，菌落生長直徑最大，達到82 mm；pH 值為10 時，菌落生長直徑最小，為65 mm；pH 值在5～7 時，菌落生長直徑無明顯差異（圖3）。

圖3 不同pH 值對病原菌落生長直徑的影響

2.6 花生果腐病發生動態

通過試點村花生田間觀察，花生果腐病病株呈片狀發生，病株葉片出現類似花生褐斑病的褐色橢圓形斑點，而正常的花生植株葉片呈綠色。從開花期以后果腐病逐漸加重發生，每年7 月15 日至8 月15日，如遇雨水過大，田間密度過大，在高溫高濕環境下致病病原菌極易侵害莢果引起腐爛。砂土地和偏干旱地塊發病較輕，只有果殼出現黑褐色病斑，如果后期濕度過高果腐病也會嚴重發生，整個莢果變黑腐爛，重茬連作地塊地下害蟲嚴重也會導致果腐病重度發生。莢果侵染癥狀為果殼剛開始出現褐色不規則小斑點，隨著病情加重發展成暗黑褐色大病斑，最后整個莢果完全變黑腐爛。果腐病發病較輕的莢果特征為果仁瘦小、發硬、停止發育，種皮色呈淺灰色；果腐病發病嚴重的莢果特征為果柄呈黑褐色，與莢果連接松散，收獲時極易脫落，莢果果仁與果殼全部腐爛有惡臭味，沒有任何利用價值。

安陽市內黃縣花生果腐病發生動態調查結果（圖4）顯示，2019 年果腐病發生相對較輕，2020 年和2021 年果腐病發生較重，連續3 a 調查的果腐病發生動態基本趨同。2019 年，果腐病發病率最高為14.60%，整體發病較輕，病情指數為15.72；2020 年，果腐病發病率最高為18.90%，病情指數為19.84；2021年，果腐病發病率最高為24.80%，病情指數為26.79。

從圖4 可以看出，在花生莢果尚未形成的苗期、開花期、下針期均未出現花生果腐病，在7 月1 日結莢初期發現有零星果腐病感染病株；7 月8 日后果腐病病情開始逐步蔓延發生，到8 月10 日果腐病發生已經比較嚴重，病情指數和發病率明顯增高；到8 月20 日成熟收獲期，果腐病發生達到峰值。

圖4 安陽市內黃縣花生果腐病發生動態

3 結論與討論

茄鐮刀菌是多種植物及動物的致病菌，在自然界中廣泛存在，能使植物發生根部腐爛、植株枯萎等癥狀，對植物生長發育造成嚴重不利影響。茄鐮刀菌是花生果腐病的主要致病病原之一［5］。

本研究通過對安陽市內黃縣的花生果腐病病原進行分離、純化、回接鑒定，證明花生果腐病首位致病病原菌是茄鐮刀菌，次致病病原菌是群結腐霉菌。病株地上植株莖、枝、葉色呈綠色，生長正常，莖基部剛開始染病時出現褐色水漬狀病斑，維管束顏色也變成褐色。莢果外殼在果腐病侵染初期會出現大小不規則深褪色病斑，隨著果腐病發展加重莢果外殼呈鐵銹色，果仁逐漸干癟，直至莢果完全變黑，果柄脫落，果仁完全腐爛喪失利用價值。

本研究結果表明，安陽市內黃縣花生在7月1 日結莢初期出現零星果腐病病株，在7 月8 日后果腐病病情開始逐步蔓延發生，到8 月10 日果腐病病情指數和發病率明顯增加，到8 月20 日成熟收獲期時果腐病病情達到頂峰。