非小細胞肺癌中PD1/PD-L1信號通路與EGFR突變的相關性研究*

孔令慧,王金花△,郭志娟,呼斯冷,牟永平,楊鵬杰

(內蒙古醫科大學附屬人民醫院 1.病理科；2.檢驗科；3.胸外科，呼和浩特 010020)

非小細胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要類型，隨著靶向治療藥物的研發，NSCLC患者生存期延長，但受多方面因素影響，部分中晚期NSCLC患者短期病死率仍較高。有研究表明，表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)是NSCLC重要的驅動基因，EGFR突變可引起腫瘤細胞生長、繁殖及修復，并可促進新生血管生成，增加化療難度，為腫瘤侵襲及轉移提供有利條件[1-2]。而目前有關EGFR基因突變的發生機制及誘因尚未明確，不利于靶向治療的合理實施。探討與EGFR突變相關的指標對及早評估患者腫瘤進展風險并實施針對性治療具有重要意義。大量研究證實，免疫系統在NSCLC患者治療獲益及預后中發揮著重要作用，可誘發腫瘤驅動基因突變，引起藥物耐受，增加腫瘤細胞侵襲及轉移能力[3-4]。由此推測，腫瘤免疫相關分子水平與腫瘤驅動基因突變具有一定的關系。基于此，本研究觀察了NSCLC中細胞程序性死亡分子1/細胞程序性死亡分子1配體(PD1/PD-L1)信號通路與EGFR突變的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2020年6月本院收治的NSCLC患者113例作為研究對象，其中男79例，女34例；年齡56～79歲，平均(65.94±5.49)歲；有吸煙史85例；有飲酒史81例；有高血壓史12例；有糖尿病史11例；有高血脂史17例；分型：腺癌69例，鱗癌32例，腺鱗癌12例；TNM分期[5]：Ⅱ期20例，Ⅲ期58例，Ⅳ期35例；病程1～3年，平均(1.85±0.57)年；腫瘤最大徑2～6 cm，平均(3.97±0.44)cm；合并胸內播散11例；合并遠處轉移6例。納入標準：(1)符合NSCLC診斷標準[6]，并經手術標本病理學檢查確診；(2)初次發病；(3)意識清晰，可配合完成相關治療及檢查；(4)對本研究知情，并簽署知情同意書。排除標準：(1)入組前接受過免疫治療、靶向治療；(2)合并自身免疫系統疾病；(3)入組前接受過放療或化療；(4)合并慢性或急性感染；(5)合并其他部位腫瘤。本研究獲醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1資料收集

于患者入院時收集患者一般資料，包括年齡、性別、吸煙史、分型、TNM分期、病程、腫瘤最大徑、合并胸內播散情況、合并遠處轉移情況等。其中TNM分期、合并胸內播散情況、合并遠處轉移情況通過病理學檢查結合X線檢查評估，腫瘤最大徑通過X線片及術后病理檢查評估。

1.2.2PD1/PD-L1檢測

取患者癌組織甲醛固定、石蠟包埋標本，以4 μm連續切片，烤片，脫蠟。在0.3%過氧化氫溶液中孵育10 min，置于枸櫞酸鹽緩沖液中修復。采用北京中杉金橋公司提供的En Vision免疫組織化學試劑盒及抗體檢測PD1/PD-L1，采用En Vision二步法進行免疫組織化學檢測，操作按試劑盒說明書進行，以磷酸鹽緩沖溶液代替一抗作為空白對照。染色結果由2名經驗豐富的病理科醫師進行評估，陽性細胞百分比計分標準：陽性細胞比例小于10%計1分，10%～50%計2分，>50%計3分。染色強度計分標準：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。二者評分乘積大于或等于3分為陽性表達，<3分陰性表達。

1.2.3EGFR突變評估

取患者癌組織甲醛固定、石蠟包埋標本評估EGFR突變情況，DNA提取試劑盒由美國Omega公司提供，采用Primer5.0軟件設計引物，引物序列參照DNA提取試劑盒，設計好的引物由上海Invitrogen公司合成。設計出的引物序列為21外顯子上游引物：5′-GCT CAG AGC CTG GCA TGA AC-3′下游引物：5′-CAT CCT CCC CTG CAT GTG TT-3′。19外顯子上游引物：5′-GTG CAT CGC TGG TAA CAT CC-3′，下游引物：5′-TCT GGA GAT GAG CAG GGT CT-3′。18外顯子上游引物：5′-TCC AAA TGA GCT GGC AAG TG-3′，下游引物：5′-TCC CAA ACA CTC AGT GAA AC-3′。提取癌組織DNA后檢測DNA濃度與純度，采用美國ABI97型聚合酶鏈反應擴增儀檢測EGFR基因突變情況，反應體系及反應條件參照儀器說明書，反應體系：2.5 Utaq DNA，250 μm脫氧核糖核苷三磷酸，2 mmol/L氯化鎂，上下游引物各0.3 μmol/L。反應條件：94 ℃反應5 min，94 ℃反應60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃反應1 min，反復循環30次。取反應產物5 μL，以2%瓊脂糖凝膠電泳觀察各條帶大小，剪取正確條帶，純化后行酶切反應。反應體系：0.15 μL Exon-1酶，0.35 μL雙蒸水，4 μL反應產物，0.5 μL 蝦堿酶，酶切條件：37 ℃恒溫反應60 min，72 ℃反應15 min。循環反應后進行測序分析，統計EGFR突變情況。

1.3 統計學處理

表1 自變量賦值情況

2 結 果

2.1 一般資料及PD1/PD-L1水平

113例患者中發生EGFR突變41例(36.28%，EGFR突變組)，未發生EGFR突變72例(63.72%，未發生EGFR突變組)，EGFR突變組患者中21號外顯子突變22例，18號外顯子突變12例，19號外顯子突變5例，18號和19號外顯子共突變2例；EGFR突變組TNM分期與未發生EGFR突變組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；EGFR突變組患者女性、合并胸內播散、PD1/PD-L1陽性占比均高于未發生EGFR突變組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組患者年齡、吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、高血脂史、腫瘤分型、病程、腫瘤最大徑、遠處轉移情況比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組患者一般資料及PD1/PD-L1水平比較

續表2 兩組患者一般資料及PD1/PD-L1水平比較

2.2 PD1/PD-L1信號通路與EGFR突變的關系

性別(女性)、TNM分期(Ⅳ期)、合并胸內播散、PD1/PD-L1陽性均與EGFR突變的發生有關(P<0.05)。見表3。

表3 PD1/PD-L1信號通路與EGFR突變的關系

2.3 EGFR突變的相關因素

性別、TNM分期、胸內播散、PD1/PD-L1均與EGFR突變的發生相關(P<0.05)。見表4。

表4 EGFR突變的相關因素(r)

2.4 PD1/PD-L1信號通路對EGFR突變的預測效能

PD1/PD-L1用于預測EGFR突變的AUC為0.772(95%可信區間：0.683～0.861，P=0.001)。見圖1。特異度為0.045，靈敏度為0.878，約登指數為0.667。

圖1 PD1/PD-L1信號通路預測EGFR突變的ROC曲線

3 討 論

免疫系統與惡性腫瘤的發病及病情發展均密切相關，免疫系統可影響惡性腫瘤患者治療獲益及預后，主要機制為免疫系統可發揮免疫效應，對腫瘤細胞具有殺傷效果，可協助治療，共同清除腫瘤細胞[7-8]。此外，腫瘤細胞具有免疫逃逸機制，可抵抗免疫系統對腫瘤細胞的殺傷效果[9]。免疫檢查點對控制免疫反應具有關鍵作用，可為腫瘤的靶向治療提供新靶點。

有研究表明，PD1/PD-L1是NSCLC患者的有效免疫治療靶點之一，并可反饋患者驅動基因突變的靶向治療敏感程度[10]。因此，對PD1/PD-L1進行研究尤為必要。本研究結果顯示，EGFR突變組PD1/PD-L1陽性占比明顯高于未發生EGFR突變組，經回歸分析檢驗結果顯示，女性、TNM分期為Ⅳ期、合并胸內播散、PD1/PD-L1陽性均與EGFR突變的發生有關；經Kendall′s tau-b相關性分析檢驗結果顯示，性別、TNM分期、胸內播散、PD1/PD-L1均與EGFR突變的發生密切相關。其中女性被證實有更高風險發生EGFR突變，但相關機制尚未明確，可能與遺傳、環境暴露、激素改變等多種因素有關[11-12]。TNM分期高及合并胸內播散患者腫瘤細胞增殖、侵襲能力強，并有新生血管形成，存在相關基因突變的風險較高[13]。而EGFR突變被證實是NSCLC突變的最常見基因之一，與上述病理特征的聯系較密切[14]。而相關研究表明，有一定比例女性NSCLC患者、高分期患者或胸內播散患者經檢測證實未發生EGFR突變，因此，性別比例及病理特征仍不能用于有效預測EGFR突變風險，仍有待于探討其他有效指標[15-16]。

PD-1屬免疫球蛋白B7-CD28家族成員，在人體的活化免疫細胞中表達，包括自然殺傷T淋巴細胞、單核-巨噬細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、樹突狀細胞等[17]。在惡性腫瘤患者中PD-1可呈異常高表達。PD-L1是PD-1的主要配體，在腫瘤細胞中也呈異常高表達。國外有研究已證實，EGFR突變與PD-1及PD-L1密切相關[18]。PD-1可與PD-L1結合，通過PD1/PD-L1通路降低CD8+T淋巴細胞及CD4+T淋巴細胞活性，并抑制二者增殖，進而抑制腫瘤局部微環境中T淋巴細胞發揮作用，對腫瘤的免疫殺傷功能降低，腫瘤易發生免疫逃逸[19-20]。因此，PD1/PD-L1陽性說明患者腫瘤細胞免疫耐受能力強，進展為突變腫瘤細胞的風險較高。

基于上述分析，推測PD1/PD-L1可用于預測EGFR突變風險，本研究繪制ROC曲線發現，NSCLC患者PD1/PD-L1用于預測EGFR突變的AUC≥0.70，具有一定的預測價值，證實假設成立。臨床醫師可根據患者PD1/PD-L1檢測結果，對PD1/PD-L1陽性患者應用免疫治療藥物及EGFR靶向藥物，以進一步提高患者治療獲益。此外，有關研究還表明，不吸煙或輕度吸煙與惡性腫瘤患者EGFR突變的發生密切相關，組織學分型與EGFR突變的發生也有關[21]。而本研究結果顯示，EGFR突變組無吸煙史、肺腺癌者占比與未發生EGFR突變組比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，可能與本研究納入整體樣本中有吸煙史者占比較高、肺腺癌者納入較少有關，未來還應擴大樣本量進一步得出研究結論。因本研究未能觀察NSCLC患者間變性淋巴瘤激酶、大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因突變發生情況，故結論尚有局限性，未來還應納入NSCLC患者觀察多基因突變情況，并分析相關指標，以進一步為臨床靶向藥物的應用提供參考。

綜上所述，NSCLC患者EGFR突變風險較高，與PD1/PD-L1陽性密切相關，可將PD1/PD-L1作為EGFR突變的預測因子，并指導針對性治療的實施，可能對提高NSCLC患者整體治療獲益具有積極意義。