組蛋白去甲基化酶NO66在常見腫瘤中的表達及臨床意義*

公利鑫，程雙華，段文芳，李靜怡,2，唐茂森

(1.成都醫學院第二附屬醫院/核工業四一六醫院，四川 610051；2.成都醫學院，四川 610500)

癌癥是世界公眾健康主要問題之一，自2010年以來癌癥已成為我國人民最主要的死亡原因。目前，癌癥的治療主要以手術為主，放化療為輔，療效與癌癥的種類及癌癥進展快慢密切相關。

最近有研究表明，組蛋白修飾在腫瘤的發生和發展中具有重要作用[1-2]。組蛋白修飾因子的改變導致轉錄程序終止，從而導致細胞表型發生劇烈變化。已有文獻報道，組蛋白甲基化狀態與癌癥進展和轉移密切相關[3]。組蛋白甲基化可由其甲基化位點不同影響染色質結構而不改變 DNA 序列，進一步影響轉錄因子對基因啟動子區域的訪問，影響轉錄功能，最終影響基因表達。染色質組蛋白修飾被認為是調控基因表達的第二遺傳密碼，甲基化修飾通常發生在組蛋白N端，將被一系列特定蛋白所識別，從而實現對特定基因表達的調節[4]。截止目前，已發現的組蛋白去甲基化酶(Jumonji domain-containing histone demethylase,JMJD)主要有兩類，一類是含 A-mino oxidase 結構域的賴氨酸特異性去甲基化酶家族[5]；另一類是含 Jumonji C特征結構域的JMJD家族[6]。JMJD家族是一類重要的去甲基化酶，可催化組蛋白H3多個位點賴氨酸的去甲基修飾，從而調節特定基因表達[7]。Jumonji C結構域含氧蛋白屬于一個具有不同底物特異性的加氧酶家族，參與調控不同的生物過程，如基因轉錄、RNA加工和翻譯[8]。

NO66是JMJD家族成員之一，以四聚體形式組裝，在細胞核和核仁中均有發現[9]。識別賴氨酸4、36作為底物，并抑制靶基因的轉錄基因[10]，且已有文獻報道，NO66與致癌轉錄因子——MYC原癌基因(MYC Proto-Oncogene，c-MYC)相互作用，促進以c-MYC為中心的致癌轉錄程序[11]。c-MYC在大多數人類惡性腫瘤中均高表達，而且其表達還與腫瘤的侵襲性密切相關[12]。此外，NO66還催化60S核糖體蛋白L8(ribosomal protein L8,RPL8)等蛋白質的組氨酸羥基化[13]，從而調節蛋白質合成。另有研究表明，NO66與zeste同源物2增強子相互作用，zeste同源物2是致癌多梳抑制復合物2的重要組成部分，并協調調控胚胎干細胞中的靶基因單元格[14]。基于這些發現，可以設想NO66在人類惡性腫瘤中作為一種腫瘤特異性組蛋白修飾物發揮作用。

目前，已有諸多研究表明，NO66在結直腸癌、前列腺癌、膠質瘤中發揮著重要作用。在結腸癌細胞中敲除NO66基因后發現，癌細胞增殖能力及遷移能力顯著降低。數據庫分析結果顯示，NO66與腫瘤的轉移、淋巴結轉移密切相關，但其機制并不清楚[15]。在膠質瘤細胞中表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是膠質母細胞瘤的關鍵致瘤因子。敲低NO66基因后降低了膠質母細胞瘤細胞中EGFR的表達和細胞增殖能力。NO66是EGFR表達和膠質母細胞瘤細胞增殖所必需的，高水平NO66表達也可預測患者預后不良。NO66與腫瘤的發生和發展已有相關報道，但其研究較少見，因此，NO66具有重要的研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌細胞PC-3、人非小細胞肺癌細胞A549、人肝癌細胞HepG2、 人膠質瘤細胞LN229、人結腸癌細胞HCT116均為本課題保種。收集結腸癌組織樣本20例，前列腺癌組織樣本14例，肝癌組織樣本18例，肺癌組織樣本20例，膠質瘤樣本5例。鼠抗人NO66單克隆抗體、山羊抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司，杜氏改良Eagle培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)、RPMI-1640培養基、胎牛血清均購自以色列BI公司，化學發光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)購自美國Millipore公司，蘇木素、伊紅均購自武漢塞維爾公司，二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)免疫組織化學(免疫組化)試劑盒購自南京建成公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

將細胞置于DMEM、RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清)培養，生長至90%左右融合度時傳代培養，取對數生長期、生長狀態良好的細胞用于后續實驗。

1.2.2Western blot檢測細胞NO66蛋白水平

取收集的細胞加入細胞裂解液裂解細胞，12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白水平，取20 μg蛋白煮沸變性10 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺電泳，轉入聚偏氟乙烯膜，加入脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(1∶200)孵育過夜，加入二抗(1∶10 000)孵育2 h，以GAPDH為內參，ECL法發光顯色，凝膠成像系統采集圖像。

1.2.3蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色

將臨床組織石蠟包埋樣本切片后通過烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水(無水乙醇-70%乙醇)、蘇木素染色3 min和伊紅染色1 min，中性樹脂封片。

1.2.4免疫組化染色

將臨床組織石蠟包埋樣本切片后烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水(無水乙醇-70%乙醇)、過氧化氫(3%)封閉內源性過氧化物酶30 min、抗原修復、胎牛血清封閉1 h、孵育一抗過夜、二抗1 h、DAB顯色、蘇木精染色、中性樹脂封片。病理評分由核工業四一六醫院病理科完成。

1.3 預后及臨床意義分析

通過腫瘤和癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫分析NO66表達高低與結腸癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、膠質瘤患者生存率、腫瘤分級分期和免疫細胞浸潤的關系。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 5種常見腫瘤組織NO66蛋白表達

結腸癌組織NO66表達最高，前列腺癌組織NO66中度表達，肺癌、肝癌組織NO66不表達。見圖1、表1～4。由于膠質瘤組織樣本較少，參考意義不大，但已有研究表明，NO66在膠質瘤中具有重要作用。

A：HE染色(200×)；B：免疫組化(400×)。圖1 5種常見腫瘤組織NO66 HE染色、免疫組化結果

表1 結腸癌組織NO66蛋白表達及與病理特征的關系(n)

表2 前列腺癌組織NO66蛋白表達及與病理特征的關系(n)

表3 肝癌組織NO66蛋白表達及與病理特征的關系(n)

表4 肺癌組織NO66蛋白表達及與病理特征的關系(n)

續表4 肺癌組織NO66蛋白表達及與病理特征的關系(n)

2.2 5種常見腫瘤細胞NO66蛋白表達

結腸癌HCT116細胞NO66高表達，前列腺癌PC-3細胞NO66表達次之，肺癌A549細胞、肝癌HepG2細胞NO66不表達。見圖2。

圖2 5種常見腫瘤細胞N066蛋白表達

2.3 33種腫瘤NO66表達分析

為探索NO66在腫瘤發生過程中的作用，通過泛癌分析方法分析了NO66在33種腫瘤中的表達，見圖3A。與正常數據比較，14種腫瘤NO66表達明顯上調，包括結腸癌(COAD)、肝癌(LIHC)、肺鱗癌(LUSC)、肺腺癌(LUAD)和膠質瘤(GBM)，3種腫瘤NO66表達明顯下調。除前列腺癌NO66表達無差異外，其余5種腫瘤NO66表達均明顯上調，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3B～G。

A：NO66基于TCGA腫瘤與正常數據的表達分析；B～G：NO66基于TCGA與GTEx數據的表達分析；a：P<0.05，與正常數據比較。圖3 33種腫瘤NO66表達分析

2.4 NO66評估腫瘤患者預后的價值

NO66對結腸癌、前列腺癌、肝癌、肺鱗癌、肺腺癌、膠質瘤等6種腫瘤患者總生存期(overall survival，OS)和無復發生存期(recurrence-free survival,RFS)的影響見圖4、5。6種腫瘤患者中只有膠質瘤患者NO66表達增加，提示OS、RFS預后不良，見圖4F、5F。

圖4 NO66對6種腫瘤患者OS的影響

圖5 NO66對6種腫瘤患者RFS的影響

2.5 NO66在膠質瘤中的臨床價值

NO66高表達腫瘤惡性程度高、預后差。見表5。

表5 TCGA數據庫確定的NO66與膠質瘤的臨床基本信息

2.6 NO66與膠質瘤中免疫細胞浸潤的關系

不同拷貝數NO66在膠質瘤(GBM)中的浸潤程度見圖6A。不同拷貝數NO66在膠質瘤的免疫細胞——T淋巴細胞與巨噬細胞浸潤水平有明顯變化。NO66表達水平與巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞浸潤均呈明顯正相關。見圖6B～G。

A：不同拷貝數NO66在膠質瘤(GBM)中的浸潤程度；B～G：膠質瘤NO66表達水平與B細胞、CD8+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞浸潤水平的相關性。圖6 NO66與膠質瘤中免疫細胞浸潤的關系

3 討 論

JMJD蛋白家族中有17種酶被認為是組蛋白去甲基化酶。盡管這些家族成員中的一些如JMJD2、JARID被認為是有前途的候選靶點，但其在實體腫瘤中的有效性和不良反應仍存在爭議。本研究重點探討了JMJD家族中的一種NO66，該酶已被證實與致癌轉錄因子——c-MYC協同工作[11]，并且與RPL8關系密切[16-17]，提示其可能是一種關鍵性的腫瘤標志物。

本研究通過免疫組化方法確定NO66在腫瘤組織樣本中的基本表達情況后，后續又通過Western blot試驗進行了驗證，得到NO66在結腸癌組織、前列腺癌組織中有較高表達的結論。后續的統計分析結果沒有達到預想的結果，反而在表達不高的膠質瘤中具有一定的生物標志物價值。但也不影響NO66作為一個重要標志物參與癌癥的發生過程的結論。目前，對NO66的研究國內外均較少見，作為一個新的標志物，毫無疑問其前途是很寬廣的，后續會繼續開展相關研究，深入探討NO66的作用機制。

為進一步了解NO66參與腫瘤發生中的過程，本研究統計了大量患者在生存率、病理分級、分期方面的數據，遺憾的是，NO66表達高低與以上病理指標少有關系，得出的唯一結論是與膠質瘤的發生和發展有關。據文獻報道，NO66在膠質瘤中通過激活EGFR和c-MYC的表達，促進膠質瘤細胞增殖[18]。已知NO66是一個多聚體，多聚體的結構是否是其發揮重要作用的必要條件，查閱文獻后得知，當NO66以四聚體形式組裝時對RPL8的羥基化催化效率最高。以各種方式破壞四聚體組裝會導致催化活性的損失。NO66的低聚化可能會影響催化過程中每個亞基的運動，從而控制活性。大量研究證實，腫瘤免疫細胞浸潤可影響放化療和免疫治療的療效和患者預后[19-20]。本研究結果顯示，免疫細胞增多與NO66表達水平呈正相關，包括膠質瘤中的巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞。表明腫瘤免疫浸潤可能部分揭示了NO66介導膠質瘤的發生和發展，提示NO66可作為膠質瘤一個關鍵的生物標志物。

綜上所述，本研究闡述了NO66在多種類型腫瘤中高表達(包括膠質瘤)，并且與膠質瘤患者的不良預后相關。此外，本研究還表明，NO66可能通過增加腫瘤免疫細胞浸潤發揮致癌作用，然而這些結果還需在未來得到更多的基礎和臨床研究驗證。