歐前胡素衍生物抑制肺癌A549細胞生長*

楊曉琪，毛景濤，劉 娟，馬維娜

(1.陜西省森林工業職工醫院胸外科,西安 710300；2.兵器工業五二一醫院腫瘤科,陜西西安 710065；3.西安交通大學醫學部藥學院，陜西 710061)

肺癌是最常見的一種呼吸系統惡性腫瘤，是全球癌癥占比最大，死亡率最高的惡性腫瘤，嚴重危害人類生命健康[1]。非小細胞肺癌占肺癌比例高達85%，而患者生存率僅為15%[2]。目前，傳統手術仍是肺癌的主要治療方法，放、化療作為輔助治療方法。然而，隨治療時間延長、耐藥細胞的出現及其他不良反應的發生，療效并不理想，不能滿足臨床需求。因此，發掘傳統中藥資源，研究中藥對惡性腫瘤的作用效果及其作用機制具有重要的科學和臨床意義[3]。

細胞凋亡是一個多種基因參與調控、高度有序、細胞內一系列酶級聯參與主動的分子調控的過程[4]。有研究表明，在腫瘤細胞中50%在凋亡機制方面存在缺陷[5]。有研究表明，B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)蛋白家族與細胞凋亡過程密切相關，已成為治療腫瘤的一個重要靶標[6-8]。同時，有研究發現，多數腫瘤是一種細胞周期調控異常的疾病[9-10]。細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)和細胞周期蛋白(Cyclins)是目前研究最為主要的調控周期的相關蛋白[11]，其與細胞的增殖和分化均密切相關[12-13]。因此，開發調控細胞周期與凋亡的藥物對腫瘤的治療至關重要。

呋喃香豆素是香豆素類化合物的一種，可分為線型呋喃香豆素和角型呋喃香豆素。香豆素因其相對分子質量較小，制備工藝簡單，在各個領域應用較為廣泛，很多藥理作用被逐漸發現，尤其是呋喃香豆素的抗腫瘤活性[14]。歐前胡素是典型的呋喃香豆素類化合物，被發現于傘形科和蕓香科植物中，在天然的藥用植物中分布廣泛，而且在白芷中含量較高。目前，對歐前胡素的藥效學研究已有一定進展，有研究發現，其除有抗炎、抗菌、鎮痛，以及對心血管、神經系統等作用外，還能抑制多種腫瘤細胞的繁殖、左右藥物代謝酶的活性,是重要的天然活性物質[15]。歐前胡素衍生物(IMP-1)為聯苯型呋喃香豆素類化合物[16]。本研究通過體外細胞實驗對IMP-1抗肺癌作用機制進行初步研究，探索IMP-1對細胞凋亡和周期調控的影響，旨在為開發治療肺癌的靶向藥物奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑

人肺癌細胞A549細胞株購自中科院上海細胞生物學研究所，RPMI-1640培養基購自上海培源生物科技股份有限公司(批號：L240KJ，含10%血清、100 IU/mL青霉素和鏈霉素，37 ℃，飽和濕度，5% CO2)，胎牛血清購自美國Thermo公司(批號：16140063)，胰酶購自北京索萊寶科技有限公司(批號：T8151)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sigma-Aldrich公司(批號：M2003)，二甲基亞砜(DMSO)購自天津市科密歐化學試劑有限公司，青霉素、鏈霉素購自華北制藥集團，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid assay，BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司(批號：5345-2018)，異丙醇及甲醇購自天津市科密歐化學試劑有限公司(批號：2892-2010、683-2006)，預染蛋白分子量標準購自ABclonal公司(批號：3452Q)，超敏增強型化學發光試劑(ECL)化學發光底物購自正四柏生物有限公司(批號：4AW011-500)，脫脂奶粉購自伊利公司(批號：050DH0310)，碘化丙定(PI)雙染法細胞凋亡檢測試劑盒及抗體購自美國Proteintech公司(批號：PF00005)，細胞分裂周期基因2(CDC2)抗體(批號：19532-1-AP)、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)抗體(批號：60186-1-lg)、細胞周期蛋白E(CyclinE)抗體(批號：11554-1-AP)、髓樣細胞白血病蛋白-1(mcl-1)抗體(批號：16225-1-AP)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)抗體(批號：12789-1-AP)、B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白(Bax)抗體(批號：50599-2-lg)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(批號：60004-1-lg)均購自美國Proteintech公司。

1.2 主要儀器

CO2恒溫培養箱(SANYO MCO-15AC)、倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、超凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術有限公司)、酶標儀(美國Bio-Rad公司)、流式細胞分析儀(艾森生物有限公司)、冷凍離心機(德國Eppendorf公司)、凝膠成像系統(北京賽智創業科技有限公司)等。

1.3 方法

1.3.1細胞增殖測定

取對數生長期A549細胞考察IMP-1對細胞增殖的影響。將細胞接種于96孔板(180 μL/孔)，放置37 ℃、5% CO2飽和濕度孵育箱中培養24 h。次日加入用無血清無雙抗培養基配制的8個濃度梯度(0.39、0.78、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L)待測藥品——IMP-1，每個濃度設置5個復孔。陰性對照為等量培養基未加藥，空白對照為等量無細胞且無血清無雙抗的培養基。加完藥后置于37 ℃、5% CO2飽和濕度孵育箱內培養。48 h后取出孔板，在超凈工作臺中進行操作，小心吸出每個孔中的培養基，加入配制好的MTT溶液(200 μL/孔)。在37 ℃、5% CO2飽和濕度孵育箱中繼續培養，4 h后將96孔板中培養基吸干凈，每孔加入DMSO 150 μL，在搖床上使其混合均勻(15 min)。使用酶標儀在490 nm波長處測定光密度值。

1.3.2細胞周期測定

待細胞生長至對數期時接種細胞于細胞培養皿中，分別標注陰性、小濃度(1.56 μmol/L)、中濃度(3.12 μmol/L)、大濃度(6.25 μmol/L)，放置37 ℃孵育箱中培養48 h，次日加藥。將細胞消化后收集至10 mL EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄培養液，加預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)清洗，1 000 r/min離心5 min。每個EP管中加入1 mL預冷的70%乙醇，在-20 ℃中放置2 h，1 000 r/min離心5 min，小心吸去乙醇后每管加入1 mL PBS，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。室溫條件下每管加1 mL RNA酶(避光操作)，反應30 min后1 000 r/min離心5 min，吸出上清液。每管加入PBS 500 μL，以及PI 25 μL染色，使用流式細胞分析儀避光檢測。

1.3.3細胞凋亡測定

待細胞生長至對數期時接種細胞于細胞培養皿中，分別標注陰性、小濃度(1.56 μmol/L)、中濃度(3.12 μmol/L)、大濃度(6.25 μmol/L)，放置37 ℃孵育箱中培養48 h，次日加藥。將細胞消化后收集至10 mL EP管中，1 000 r/min離心5 min，棄培養液，加預冷的PBS清洗，1 000 r/min離心5 min。按凋亡試劑盒說明書操作，對細胞進行PI和異硫氧酸熒光素-膜聯蛋白V(Annexin V-FITC)雙染色。在4 ℃下避光孵育20 min后用流式細胞分析儀檢測。

1.3.4蛋白免疫印跡(Western blot)分析

取對數生長期的A549細胞接種于細胞培養皿中，分組給藥后加入細胞裂解液進行細胞裂解，抽提蛋白采用BCA試劑盒進行定量檢測，并與適量上樣緩沖液混合，加熱煮沸5 min使蛋白變性。同時按說明書進行聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配飾，以每孔20 μg蛋白量進行電泳，待電泳完畢后將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，然后采用5%脫脂奶粉封閉1 h。棄封閉液，采用三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽(TBST)漂洗，并孵育一抗4 ℃過夜。采用TBST漂洗后加入二抗室溫振蕩1 h，進行ECL曝光，采用IPP5.0圖像處理軟件進行灰度定量分析。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 IMP-1對A549細胞增殖的影響

IMP-1化學結構式見圖1A。IMP-1對肺癌細胞(A549、HCC827及NCI-H460)具有明顯的增殖抑制作用且呈劑量依賴關系，對A549細胞的敏感性最強，因此后續實驗采用A549細胞作為研究對象。見圖1B。IMP-1對A549細胞生長具有明顯抑制作用，且呈良好的劑量依賴關系。其半數抑制濃度為3.62 μmol/L。見圖1C。

A：IMP-1化學結構式；B：IMP-1抑制肺癌細胞增殖；C：IMP-1抑制A549細胞增殖。圖1 IMP-1抑制肺癌細胞增殖

2.2 IMP-1對A549細胞周期的影響

IMP-1對A549周期變化有明顯影響，隨藥物濃度增大G1期細胞逐漸增多，分別為35.39%(陰性)、39.11%(1.56 μmol/L)、43.92%(3.12 μmol/L)、47.66%(6.24 μmol/L)。見圖2。表明IMP-1可阻滯細胞于G1期，從而延長細胞周期，抑制細胞增殖。

A：細胞周期流式;B:細胞周期流式定量。圖2 IMP-1對A549細胞周期的調控作用

2.3 IMP-1對A549細胞周期相關蛋白的影響

IMP-1作用于A549細胞后明顯下調CyclinE、CyclinD1、CDC2的表達水平。見圖3。

A：周期相關蛋白Western blot條帶;B:CDC2定量;C:CyclinD1定量;D:CyclinE定量;*：P<0.05;**:P<0.001，與陰性組比較。圖3 IMP-1對A549細胞周期相關蛋白表達的影響

2.4 IMP-1對A549細胞凋亡的影響

IMP-1對A549細胞具有明顯誘導凋亡的作用，且隨藥物濃度遞增細胞凋亡率增多。見圖4。

圖4 IMP-1對A549細胞凋亡的調控作用

2.5 IMP-1對凋亡相關蛋白表達的影響

IMP-1作用于A549細胞后明顯下調抗凋亡蛋白——Mcl-1、Bcl-2的表達水平，上調促凋亡蛋白——Bax的表達水平。見圖5。

A：凋亡蛋白Western blot條帶;B:Mcl-1定量;C:Bcl-2定量;D:Bax定量;*：P<0.05;**:P<0.001，與陰性組比較。圖5 IMP-1對A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響

3 討 論

肺癌是一種常見的惡性腫瘤，發病率及死亡率逐年增加，嚴重威脅人類身體健康[17]。前期文獻報道了歐前胡素具有抗腫瘤作用，為進一步研究其機制，本研究對其結構進行了優化，得到其衍生物——IMP-1，進而進行了IMP-1抗肺癌作用的初步研究。采用MTT法進行初篩后結果顯示，IMP-1對A549細胞增殖抑制效果明顯，且呈濃度依賴性。

細胞周期異常可導致腫瘤細胞無限增殖，調控參與細胞周期的相關蛋白能抑制腫瘤細胞的活性，并阻滯腫瘤細胞的無限增殖，達到治療腫瘤的目的[18]。本研究結果顯示，IMP-1對A549周期變化具有明顯影響，隨藥物濃度增大G1期細胞逐漸增多，表明IMP-1可阻滯細胞于G1期，從而延長細胞周期，抑制細胞增殖。CyclinD1為G1期進展的限速調節因子，CyclinD1表達水平下降可阻滯細胞于G1期；CyclinE是細胞周期從G1期轉向S期的重要蛋白，其表達水平減少可阻滯細胞由G1期進入S期；CDC可與CyclinA、CyclinB結合控制S期至G2期和G2期至M期2個控制點，因此，CDC表達減少，抑制細胞從S期至G2期和G2期至M期。本研究Western blot檢測結果顯示，IMP-1可下調CyclinD1、CyclinE、CDC2的表達水平，從而抑制細胞增殖。

凋亡過程的紊亂與腫瘤的發生具有直接或間接的關系，由于腫瘤細胞無法對其生長進行正常調控，導致無限增殖[19]。本研究結果顯示，IMP-1可有效誘導A549細胞凋亡，且隨給藥濃度增加細胞凋亡比例依次上升。Bcl-2蛋白家族是細胞凋亡相關內源性線粒體通路的關鍵蛋白，主要包括促凋亡蛋白——Bax、Bcl-2相關K蛋白(Bcl-2 associated K protein，BAK)等和抗凋亡蛋白——Bcl-2、Mcl-1等[20]。本研究Western blot檢測結果顯示，IMP-1可下調抗凋亡蛋白——Mcl-1、Bcl-2的表達水平，上調促凋亡蛋白——Bax的表達水平，從而誘導細胞凋亡。

綜上所述，IMP-1通過下調CyclinD1、CyclinE、CDC2蛋白的表達水平，阻滯A549細胞于G1期；同時，通過下調抗凋亡蛋白——Mcl-1、Bcl-2蛋白的表達水平，上調促凋亡蛋白——Bax蛋白的表達水平誘導細胞凋亡，從而抑制肺癌細胞A549的增殖。本研究結果為系統研究IMP-1抗腫瘤作用奠定了基礎。