電針對缺氧缺血性腦損傷大鼠海馬神經(jīng)元自噬及IGF-1/PI3K/Akt通路的影響

曹 娟, 王紅怡, 王麗欣, 陳小寧, 林 秋,楊慶紅, 陳東追, 符玉秀

(1. 海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院, 海南 海口, 571100;2. 海南醫(yī)學院基礎醫(yī)學與生命科學學院免疫學教研室, 海南 海口, 571100)

缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是一種因氧氣和流向大腦的腦血流減少導致神經(jīng)功能缺損而引發(fā)的疾病，是新生兒中常見且嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，也是導致新生兒死亡的主要原因之一[1]。幸存的嬰兒通常伴有腦癱、智力低下和其他后遺癥，嚴重影響生存質(zhì)量[2]。目前，臨床尚缺乏用于治療HIBD的標準和具體措施，因此迫切需要尋找新的神經(jīng)保護療法來減輕HIBD導致的神經(jīng)損傷。近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子1(IGF-1)與HIBD關系密切，具有促進神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞增生分化和營養(yǎng)支持的功能，在腦缺血、缺氧后保護神經(jīng)元、修復受損神經(jīng)元及恢復認知功能損害等過程中發(fā)揮重要作用，有望作為腦保護劑用于臨床缺血缺氧的治療。

自噬參與HIBD的發(fā)生，研究[4-5]發(fā)現(xiàn)當缺氧缺血刺激誘導自噬過度激活時會加劇腦損傷，在HIBD后通過抑制自噬激活可發(fā)揮神經(jīng)保護作用。研究[6]顯示針刺可通過上調(diào)IGF-1的表達來改善腦卒中后血管性認知障礙，促進神經(jīng)發(fā)育，治療小兒腦性癱瘓[7]。電針是在針灸針上接通微量不連續(xù)或連續(xù)的電流，以進一步將針刺刺激產(chǎn)生的效應傳導至大腦，從而促進神經(jīng)功能的恢復與重塑[8]。電針能提高IGF-1表達水平，改善腦梗死患者神經(jīng)功能及腦血流動力學[9]。IGF-1主要通過調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)發(fā)揮神經(jīng)保護作用[10-11]。本研究通過建立新生大鼠HIBD模型，探討電針對新生大鼠IGF-1的影響及其可能的作用機制，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Sprague Dawley孕鼠15只，產(chǎn)仔10～12只，購自上海SLAC實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2019-0006, 動物質(zhì)量合格證號為202021 563.65。將孕鼠在單獨的無菌塑料籠中飼養(yǎng)，在22～23 ℃、55%～60%濕度以及12 h光照與12 h黑暗的周期交替下進行，孕鼠可自由進食和飲水。使用108只7 d日齡的Sprague Dawley(SD)大鼠幼崽進行實驗，體質(zhì)量15～20 g。本研究獲得機構動物護理和使用委員會批準{2020[倫理]第(3)號)}，并遵循《實驗動物的護理和使用指南》。

1.2 主要試劑及儀器

IGF-1(瑞士Roche公司，貨號250-19); LY294002(PI3K抑制劑，北京百奧萊博科技有限公司，貨號YT333); HE染色試劑(C0105)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA試劑盒(P0010)均購自碧云天生物科技公司; 大鼠胰島素樣生長因子1(IGF-1)檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，貨號ZN2874-HXK); 兔抗大鼠PI3K(ab191606)、p-PI3K(ab182651)、AKT(ab18785)、p-AKT(ab38449)、LC3A/B(ab128025)、Beclin-1(ab210498)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor?488)(ab150077)(綠色)、小鼠抗NeuN(ab279296)、山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor?594)(ab150116)(紅色)均購自英國abcam公司。

電針儀(G6805-2A)購自上海華誼醫(yī)療儀器有限公司; 透射電子顯微鏡(H-7500)購自日本日立公司; iMark680多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置(美國Bio-Rad公司); 倒置熒光顯微鏡(IX73)購自日本Olympus公司。

1.3 分組、模型制備及處理

從108只新生大鼠中隨機選取18只為假手術組，均用3%的異氟烷麻醉，并在整個手術過程中以2%的麻醉劑量進行維持。除假手術組外，其他大鼠采用左頸總動脈結扎和低氧處理2 h的方法構建新生大鼠HIBD模型[12]。在頸部中線做小切口，分離并結扎左頸總動脈; 縫合切口，將幼崽置于加熱的毯子上恢復1 h, 而后將其放入部分浸沒在37 ℃水浴中的500 mL密封廣口瓶中; 將含8%氧氣和92%氮氣的混合氣體送入廣口瓶中2 h; 將大鼠移出并暴露于空氣中，觀察大鼠的自由運動，然后將其放回各自的母鼠籠中。假手術組僅分離左頸總動脈，不進行結扎和缺氧處理。若大鼠出現(xiàn)乏力、站立不穩(wěn)、左側肢體癱瘓與提尾時左側前爪緊抱等表現(xiàn)，提示HIBD模型構建成功。造模成功后存活72只大鼠，死亡18只，考慮到新生大鼠各器官發(fā)育不完善，造模比較艱難，故造模成功率80%屬正常可接受的范圍。

將模型制備成功的大鼠隨機分為4組，即模型組、IGF-1組(0.2 mg/kg)[13]、電針組、電針聯(lián)合LY294002組(電針+PI3K抑制劑0.3 mg/kg)[14], IGF-1組在缺氧缺血后即刻腹腔注射IGF-1(0.2 mg/kg), 電針組在造模后2 h按照實驗動物學所公認的針灸取穴位置，選取神庭(大鼠頭前正中線，額頂骨縫交線前方)、百會穴(大鼠頭部前正中線，兩耳尖連線中點)開始電針治療，應用G6805-2A電針儀進行電針刺激，電壓峰值4 V, 疏密波，以針體輕輕抖動為標準，頻率維持在5～10 Hz, 10 min/次, 1次/d; 電針聯(lián)合LY294002組在缺氧缺血后即刻腹腔注射LY294002(0.3 mg/kg), 造模后2 h開始電針治療，操作方法同電針組。電針治療14 d后進行取材和相關指標的檢測。

1.4 取材及指標檢測

1.4.1 神經(jīng)功能缺陷評分: 各組大鼠在手術清醒后和電針治療結束后進行神經(jīng)行為評分。評分標準: 0分為無明顯神經(jīng)功能缺損; 1分為提尾時不能伸展對側前肢; 2分為行走時向對側旋轉; 3為行走時向對側傾斜; 4分為不能自主活動或伴意識障礙。分數(shù)越高表示神經(jīng)功能缺陷越嚴重。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測腦組織IGF-1的含量: 行為學檢測結束后，每組隨機選取6只大鼠，斷頭取腦，分離海馬組織，稱重后按1∶9的比例加入預冷的生理鹽水，研磨后離心，取上清為10%的腦組織勻漿, ELISA試劑盒檢測大鼠腦組織勻漿中IGF-1的含量。

1.4.3 腦組織病理學變化: 每組隨機選取6只大鼠進行麻醉，用4.0%多聚甲醛與2.5%戊二醛的混合溶液灌注，然后斷頭取腦，沿冠狀位切分為2個部分，一部分經(jīng)2.5%戊二醛溶液固定，用于透射電鏡; 另一部分經(jīng)4.0%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片后行HE染色，觀察腦組織病理學變化。

1.4.4 透射電鏡觀察細胞自噬情況: 取戊二醛溶液固定的腦組織，采用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗3次后, 1%鋨酸固定液, 4 ℃固定2 h。梯度酒精脫水，浸透包埋，行超薄切片(60～70 nm厚)，染色，顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)自噬小體的形成情況并拍照。

1.4.5 免疫熒光雙標法檢測LC3與神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)的共定位表達: 取1.4.3步驟中的腦組織石蠟切片，二甲苯脫蠟, 磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后微波修復15 min, 正常山羊血清封閉20 min, 加入一抗(兔抗LC3和小鼠抗NeuN, 1∶100), 4 ℃孵育過夜，洗去一抗，分別加入熒光二抗(Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔和Alexa Fluor 594標記的山羊抗小鼠IgG, 1∶300), 37 ℃避光孵育1 h, PBS沖洗3次，抗熒光淬滅劑封片，顯微鏡下對切片進行觀察和拍照。

1.4.6 Western blot法檢測海馬組織PI3K/Akt通路、自噬相關蛋白的表達: 每組剩余6只大鼠，取腦，分離海馬組織。按照試劑盒說明書的操作提取海馬組織中的總蛋白, BCA法測定蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品上樣, SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉法轉膜, 5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、自噬基因Beclin-1、LC3A/B, 按1∶1 000的比例稀釋; β-actin按1∶2 000的比例稀釋), 4 ℃下孵育過夜, HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h, ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，通過與內(nèi)參的灰度比得出目的條帶的相對表達水平。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

在模型制備前，所有大鼠的神經(jīng)功能均正常; 模型制備成功后，與假手術組相比，HIBD模型組大鼠出現(xiàn)行動遲緩、活動減少、左側肢體癱瘓、提尾時左側前爪緊抱等表現(xiàn)，神經(jīng)功能缺損評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 治療結束后，與模型組相比, IGF-1組、電針組、電針聯(lián)合LY294002組神經(jīng)功能改善，神經(jīng)功能缺損評分降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與電針組相比，電針聯(lián)合LY294002組神經(jīng)功能缺損評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 分

2.2 各組大鼠腦組織IGF-1的含量

與假手術組相比，模型組大鼠腦組織IGF-1的含量降低; 與模型組相比, IGF-1組、電針組、電針聯(lián)合LY294002組大鼠腦組織IGF-1的含量增加; 與電針組相比，電針聯(lián)合LY294002組腦組織IGF-1的含量降低; 上述組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織IGF-1的含量

2.3 各組大鼠腦組織病理學變化

假手術組大鼠腦組織海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)規(guī)則、排列緊密，未出現(xiàn)明顯的損傷; 模型組大鼠海馬中存在嚴重的病理損傷, CA1區(qū)可見神經(jīng)元腫脹、細胞核固縮、排列疏松、神經(jīng)元密度降低; IGF-1組、電針組大鼠上述病理改變明顯減輕，神經(jīng)元密度增加; 與電針組相比，電針聯(lián)合LY294002組大鼠海馬神經(jīng)細胞數(shù)量明顯減少。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織HE染色(放大倍數(shù)200倍)

2.4 各組大鼠海馬CA1區(qū)自噬情況

假手術組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結構基本正常，胞質(zhì)內(nèi)細胞器形態(tài)及數(shù)量正常，未見自噬小體/溶酶體的形成; 模型組大鼠海馬CA1區(qū)細胞結構破壞，呈空泡樣變的神經(jīng)元較多，可見大量溶酶體和自噬小體形成; IGF-1組、電針組大鼠海馬CA1區(qū)可見自噬小體/溶酶體數(shù)量減少，且細胞形態(tài)相對正常，可見相對完整的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng); 與電針組相比，電針聯(lián)合LY294002組自噬小體/溶酶體數(shù)量增加。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)自噬情況(放大倍數(shù)30 000倍)

2.5 各組大鼠海馬CA1區(qū)LC3與NeuN的共定位表達

假手術組大鼠海馬CA1區(qū)未見LC3與NeuN共表達的神經(jīng)元; 模型組海馬中可見大量LC3/NeuN強陽性的LC3神經(jīng)元; IGF-1組、電針組大鼠海馬CA1區(qū)LC3/NeuN共表達的神經(jīng)元明顯減少; 與電針組相比，電針聯(lián)合LY294002組LC3/NeuN共表達的神經(jīng)元數(shù)量增加。見圖3。

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)LC3與NeuN的共定位表達(放大倍數(shù)200倍)

2.6 各組大鼠海馬組織PI3K/Akt通路、自噬相關蛋白的表達

Western blot法檢測結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠海馬組織中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表達降低, Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達升高; 與模型組相比, IGF-1組、電針組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表達升高, Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達降低; 與電針組相比，電針聯(lián)合LY294002組海馬組織p-Akt/Akt的表達降低, Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達升高; 上述組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 各組大鼠海馬組織PI3K/Akt通路、自噬相關蛋白的表達

表3 各組大鼠腦組織PI3K/Akt通路、自噬相關蛋白的表達

3 討 論

HIBD可能引起永久性的腦損傷，導致神經(jīng)系統(tǒng)殘疾甚至死亡。在缺血的早期階段，海馬神經(jīng)元很容易受損，而壞死、凋亡和自噬是神經(jīng)元死亡的主要途徑。自噬參與了HIBD的發(fā)病機制，有研究[15]認為促進自噬或可部分緩解HIBD病情，但當缺氧、缺血刺激誘導自噬過度激活時，則會加劇腦損傷[16]。本研究結果顯示, HIBD模型大鼠具有明顯的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，通過觀察海馬神經(jīng)細胞的超微結構變化，發(fā)現(xiàn)HIBD大鼠缺血側CA1區(qū)細胞結構破壞，溶酶體和自噬小體數(shù)量顯著增多，免疫熒光共定位結果進一步顯示海馬LC3/NeuN共表達的神經(jīng)元顯著增多，說明HIBD大鼠海馬神經(jīng)元自噬被激活。研究[17-18]表明自噬的抑制在體內(nèi)和體外的新生兒腦缺氧、缺血模型中可以提供神經(jīng)保護作用。

針刺對HIBD的療效肯定[7-8]。研究[19-20]發(fā)現(xiàn)，針刺可通過改善腦血流量、調(diào)節(jié)自噬、抑制細胞凋亡、促進神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體表達、刺激神經(jīng)干細胞的增殖和分化等發(fā)揮對損傷腦組織的保護作用。電針是在針灸針上接通微量電流，可加強針刺刺激產(chǎn)生的效應，在鎮(zhèn)痛、緩解肢體痙攣、改善運動障礙等方面療效顯著，具有不良反應少、可重復性好、療效佳等優(yōu)點。黃金等[21]發(fā)現(xiàn)，電針可上調(diào)大鼠皮質(zhì)及海馬區(qū)PI3K、AKT、Beclin-1的表達，改善腦卒中后認知障礙; 孫曉偉等[22]發(fā)現(xiàn)電針在再灌注中晚期可降低LC3A/B蛋白表達，抑制腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)細胞自噬的過度激活，從而拮抗神經(jīng)元的進一步損傷; 黃倩茹等[23]發(fā)現(xiàn)電針可促進缺氧缺血性腦損傷大鼠的發(fā)育; 上述研究均說明電針可能通過調(diào)節(jié)自噬來減輕腦缺血缺氧后的神經(jīng)元損傷。本研究結果顯示，電針干預后大鼠神經(jīng)功能缺損情況明顯減輕; HE染色和免疫熒光共定位結果顯示電針可減少海馬神經(jīng)元丟失，減少自噬小體和LC3陽性表達的神經(jīng)元的數(shù)量，減輕海馬組織損傷; 上述結果說明電針可能通過抑制自噬減輕新生大鼠HIBD。

IGF-1是一種活性單鏈多肽分子，廣泛存在于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，可以透過血腦屏障，是維持神經(jīng)元存活的神經(jīng)因子之一，能對各種神經(jīng)損傷產(chǎn)生反應，激活多種細胞內(nèi)信號傳導通路。UMRAN R M等[24]研究表明，新生兒在子宮內(nèi)或出生時發(fā)生缺血缺氧時, IGF-1水平較低，與HIBD的預后相關; 增加神經(jīng)細胞對IGF-1的分泌作用可能減輕HIBD[3-4]。實驗和臨床研究均表明早期補充IGF-1可以減少缺氧/缺血事件后的腦損傷[25-26]。本研究結果也顯示，與正常新生大鼠相比, HIBD大鼠腦組織中IGF-1水平顯著降低，而給予IGF-1和電針干預后, IGF-1的水平明顯增加，海馬神經(jīng)元損傷減輕，說明電針可能是通過上調(diào)IGF-1的表達而減輕新生大鼠HIBD。PI3K/Akt信號通路是其發(fā)揮作用的主要通路, Akt是PI3K途徑的中心介質(zhì), IGF-1與其受體結合后，可通過PI3K激活Akt的磷酸化，進一步磷酸化下游的mTOR及其他靶蛋白，從而介導炎癥、自噬和凋亡等多種生物學效應，并對新生大鼠腦缺氧缺血損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用[14]。WANG X W等[5]發(fā)現(xiàn)IGF-1通過IGF-1R/PI3K-Akt-mTOR途徑抑制帕金森病動物和細胞模型中的過度自噬; ZHAO B等[27]發(fā)現(xiàn)在缺氧缺血性腦病中, IGF-1可改善缺氧引起的磷酸化Akt的下調(diào)，保護神經(jīng)干細胞免受缺氧誘導的凋亡。本研究結果顯示，給予IGF-1和電針干預后, HIBD大鼠海馬組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt的表達顯著升高, Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達顯著降低；使用PI3K的抑制劑LY294002能顯著降低IGF-1的水平，減弱電針對海馬組織IGF-1/PI3K/Akt通路的激活和海馬神經(jīng)元自噬的抑制作用; 上述結果提示電針可能通過激活IGF-1/PI3K/Akt通路來抑制HIBD大鼠海馬神經(jīng)元過度自噬。

綜上所述，電針可能通過激活IGF-1/PI3K/Akt通路而抑制海馬神經(jīng)元過度自噬，減輕新生大鼠HIBD。由于自噬的雙重作用，在腦缺氧缺血的不同時期，電針可能發(fā)揮不同的作用，其在腦缺氧、缺血的早期對自噬的影響有待進一步的研究。