干白葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量及影響因素調查

阮仕立，王宏安，張杰，劉建勇，李金金，李超，王磊，王根杰，李記明

（1. 煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司技術中心/山東省葡萄酒微生物發酵技術重點實驗室，山東煙臺 264001；2. 陜西丹鳳安森曼酒莊有限公司，陜西丹鳳 726200）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，簡稱EC），是大多數發酵食品（如面包、牛奶等）和酒精飲料（啤酒、白酒、葡萄酒等）生產和貯存過程中的一種天然副產物。2007年，國際癌癥研究機構將EC的致癌級別由之前的2B類提升認定為2A類。一些主要葡萄酒生產國也相繼制定了葡萄酒中EC的限定標準。美國葡萄餐酒中的EC限量為15 μg·L-1，加拿大、韓國和捷克葡萄酒中的EC限量為30 μg·L-1[1]。目前，我國仍未制定葡萄酒中EC的限量標準。近年來，隨著我國居民消費水平的提高，葡萄酒的消費量也日益上升，EC作為一種潛在的致癌物質已經逐漸引起社會關注，并成為熱門的研究對象。

葡萄酒中EC的形成途徑主要有兩個：一是尿素與乙醇結合生成，二是瓜氨酸與乙醇結合生成。尿素的主要來源有原料本身所含有的和在酒精發酵過程中精氨酸被微生物降解產生的；瓜氨酸的主要來源有葡萄汁中本身自有的，另外是在葡萄酒釀造后期精氨酸通過蘋果酸-乳酸發酵降解而產生的。因此，葡萄酒中EC的形成與尿素、瓜氨酸、精氨酸三種底物的含量密切相關[2-3]。原酒在儲存和運輸過程中的高溫對其中EC的生產有顯著影響，隨著儲存溫度的升高和時間的延長，酒中EC含量增長率呈明顯上升趨勢[4-5]。也有研究表明，脲酶可以降解尿素，從而降低EC的含量[6-7]。本研究主要通過對葡萄原料、發酵原酒和成品酒中EC及其底物（尿素、瓜氨酸、精氨酸）的測定，調查葡萄酒釀造過程中EC生成的影響因素，并提出相應的控制措施。

1 酒樣來源及調查方法

1.1 酒樣

試材由3部分組成：新疆、寧夏、煙臺產區2018年份‘雷司令’‘貴人香’‘霞多麗’原酒19個；國內2014—2018年份成品干白葡萄酒21個；不同國家（產區）的成品干白葡萄酒20個。

1.2 調查方法

1.2.1 樣品處理

本試驗中EC及底物含量的檢測時間為2019年。

（1）新發酵干白原酒中EC含量調查。取2018年新疆（6款‘雷司令’和1款‘霞多麗’）、寧夏（6款‘貴人香’、1款‘霞多麗’）和煙臺（5款‘貴人香’）3個產區按正常干白發酵工藝釀造的共計‘雷司令’6款、‘貴人香’11款、‘霞多麗’2款干白原酒樣品。在酒精發酵結束進行皮渣分離后在不銹鋼罐中靜置2周，用深綠色750 mL玻璃瓶取樣，橡木塞封口，實驗室中常溫、避光、臥放儲藏，在第3、6、9月時檢測原酒中的EC含量。

（2）不同年份成品干白葡萄酒中EC含量調查。取2014—2018年的21個成品干白葡萄酒，常溫下貯存，在第3、6個月時取樣用于檢測追蹤其中的EC變化。

（3）不同國家干白葡萄酒中EC含量調查。從市場上購買20款國內外生產的干白葡萄酒，常溫避光貯藏，在第0、3、6個月時檢測其中的EC，跟蹤檢測EC含量的變化。

（4）不同產區干白原酒中EC底物的含量差異。對2018年新疆、寧夏和煙臺3個產區新發酵的干白原酒進行EC底物（尿素、瓜氨酸、精氨酸）的檢測。

（5）貯藏溫度對干白葡萄酒中EC的影響。取不同尿素含量水平下的2017年、2018年發酵的干白原酒、和成品干白葡萄酒分別置于5、20、30、40 ℃條件下儲存，在第3、6、9個月進行EC檢測。

（6）脲酶處理對EC的影響。選擇兩種脲酶（1#和2#）對2018年新發酵的干白原酒進行處理，添加量均為10 mg·L-1。每種脲酶設4個重復，將酒樣置于20 ℃條件下1個月，檢測酒樣中的尿素和EC含量，以不加脲酶為對照；再將同一酒樣放置于40 ℃條件下1個月后，再次檢測酒樣中的尿素和EC含量。另取一組酒樣外加100 mg·L-1尿素，再分別添加10 mg·L-1的上述2個脲酶，以不加脲酶為對照，以同樣溫度處理后分別在1個月后檢測尿素和EC含量。

1.2.2 EC及其底物的檢測

尿素的測定按照QB/T 4710—2014（發酵酒中尿素的測定方法 高效液相色譜法）；精氨酸、瓜氨酸的測定參照QB/T 5197—2017（葡萄酒中12種游離氨基酸的測定 高效液相色譜法）；氨基甲酸乙酯按照GB 5009.223—2014（食品安全國家標準—食品中氨基甲酸乙酯的測定）進行測定。

2 結果與分析

2.1 新發酵干白原酒中EC含量情況

檢測新發酵干白原酒中EC含量結果表明，3個品種的干白原酒發酵結束后EC含量均小于5 μg·L-1，在室內常溫存放6個月后EC未見增加，仍然小于5 μg·L-1。在第9個月時，新疆產區酒樣均未有EC檢出；煙臺的5款‘貴人香’中的4款有EC被檢出，含量為8.3～10.20 μg·L-1；寧夏產區6款‘貴人香’中5款有EC檢出，最高為27.60 μg·L-1，最低為9.30 μg·L-1，且該區的1款‘霞多麗’EC達到19款酒的最高值，為28.80 μg·L-1。

2.2 不同年份成品干白葡萄酒中EC含量情況

由表1可見，所有干白葡萄酒樣品中EC含量普遍較高，這可能與酒中底物含量偏高以及貯藏溫度有關。酒齡越長的干白葡萄酒，其EC含量越高。隨著貯藏時間的延長，在儲藏6個月內，所有的干白葡萄酒中EC含量均呈緩慢增加的趨勢。2014—2018年的干白產品其EC增長率（6個月）不同，但酒齡較短的酒（2018年份）的EC增長率更高。

表1 成品干白葡萄酒中EC含量情況Table 1 Content of EC in dry white wine

2.3 不同國家干白葡萄酒中EC含量情況

在不同國家的干白葡萄酒中，大部分樣品中可檢出EC存在，但含量有所差異。由表2可知，在3次檢測中，EC平均含量最高的酒樣來自中國，達到16.5 μg·L-1；最低的是西班牙酒，為5.0 μg·L-1。與初始相比，第6個月所有的干白葡萄酒中EC含量都有增加，其中美國的增長率最高，達到74.38%；意大利的增長率最低，為18.97%。

表2 不同國家干白葡萄酒中EC含量Table 2 Contents of EC in dry white wine from different countries

2.4 不同產區干白原酒中EC底物調查

由圖1可見，不同產區干白原酒的尿素、瓜氨酸、精氨酸含量差別明顯。尿素水平在0.3～62.2 mg·L-1，其中寧夏產區普遍偏高，平均值為31.5 mg·L-1；煙臺產區為7.7 mg·L-1；新疆產區最少，平均值為2.5 mg·L-1。瓜氨酸水平在0～204.4 mg·L-1，平均含量新疆產區最高，平均值為67.1 mg·L-1；其次為煙臺產區24.5 mg·L-1，寧夏產區最少為21.2 mg·L-1。精氨酸水平在55～1012 mg·L-1，平均含量煙臺產區最高，平均值為640.0 mg·L-1；其次為新疆產區440.0 mg·L-1，寧夏產區最少為185.0 mg·L-1。

圖1 不同產區干白原酒的尿素、瓜氨酸、精氨酸含量情況Figure 1 Contents of urea, citrulline and arginine in dry white wine from different areas

2.5 儲存溫度對干白葡萄酒中EC含量的影響

由表3可見，5個樣品中溫度對EC含量影響的差別非常大，總體表現為隨著儲存溫度的升高和時間的延長，EC含量增長率呈明顯上升趨勢。如2017年的兩個酒樣中，5 ℃ 條件下EC增長率較低，為8.73%～11.63%；但40 ℃條件下，EC增長率最高，達到143.88%～339.88%。同時EC增加與尿素含量呈正相關，尿素含量越高，相對應EC含量也越高。但在2018年份樣品中，這個規律性不顯著，2018年尿素為21.5 mg·L-1的樣品中，40 ℃處理時EC含量153.29 mg·L-1低于其他低尿素的3個樣品，且尿素為7.5、11.3 mg·L-1的兩個酒樣在5、20 ℃處理時未檢出EC。

表3 不同尿素水平下溫度對干白葡萄酒中EC含量的影響Table 3 Effect of temperature on EC content in dry white wine under different urea level

2.6 脲酶處理對EC的影響

由表4可見，兩種脲酶處理后的干白葡萄酒中均未檢出EC，均能明顯降低尿素含量，但2#效果比1#稍差。在高濃度尿素（加100 mg·L-1尿素）存在的情況下，對照樣品1個月后EC含量增加至105.8 μg·L-1。而用1#脲酶處理1個月后，尿素降為1.2 mg·L-1，EC未檢出。2#脲酶處理1個月后尿素降為10.3 mg·L-1，EC含量為8.5 μg·L-1，約為對照樣105.8 μg·L-1的8%。

表4 脲酶處理對干白葡萄酒中尿素和EC含量的影響Table 4 effect of urease treatment on urea and EC content in dry white wine

3 結論

隨著貯藏時間的延長，干白中EC含量均呈緩慢增加的趨勢。本試驗明晰了煙臺、寧夏、新疆3個產區干白原酒中尿素、瓜氨酸、精氨酸含量情況，為生產中針對性的控制EC底物含量提供了數據支撐。

溫度對EC含量影響很大，隨著儲存溫度的升高和時間的延長，EC含量增長率呈明顯上升趨勢。調查的4個溫度條件下EC含量的增長情況說明，在儲藏溫度為20 ℃ 條件下，個別樣品在儲存6個月時EC增長率達到了114.75%，因此，儲藏溫度不應超過20 ℃。EC含量與尿素底物含量正相關，尿素含量越高，相對應的EC含量越高[8-13]。另外，脲酶處理可以顯著降低葡萄酒中尿素含量。

根據本試驗研究及國內外其他相關研究，要控制葡萄酒中的EC處于較低水平，首先要嚴格控制葡萄原料中EC底物水平，尤其是在葡萄生長中后期要嚴格控制葡萄原料的氮肥使用量，最大限度減少葡萄原料中的氮源[14-15]；其次在發酵過程中，應優先選擇產EC較少的酵母，嚴格控制營養鹽的使用，在保證發酵正常情況下，最大限度減少發酵醪中的氮素營養；發酵溫度控制在較低的水平；優先選擇產EC較少的乳酸菌；盡量不帶酵母泥陳釀，原酒澄清過濾后進行陳釀[16-18]；第三，在原酒儲藏過程中，改善貯藏環境，盡量低溫儲藏，低溫運輸；第四，在出廠環節，嚴格出廠檢驗，嚴控EC及其底物限量，控制在較低水平；最后，在成品酒貯運、銷售環節，應對產品貯運環境、倉庫溫度提出明確要求，盡可能降低運輸及儲藏溫度，溫度應不超過（含）20 ℃[19-21]。