靜態(tài)頂空/氣相色譜-質譜聯(lián)用法測定葡萄蒸餾酒中的高級醇

郭亞蕓，史紅梅，丁杰，王顯蘇

（山東省葡萄研究院/山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術創(chuàng)新中心，山東濟南 250100）

葡萄蒸餾酒是以葡萄為原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、勾兌而成的飲料酒[1]。高級醇是葡萄蒸餾酒中主要風味物質之一，其含量極大地影響著蒸餾酒的品質及安全性。高級醇，又稱雜醇油，一般指具有3個及以上碳原子的一元醇[2]，是酵母在酒精發(fā)酵過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[3]。高級醇種類和含量對蒸餾酒的香氣特征和風味起著決定性作用，適量的高級醇能夠使酒體醇甜、豐滿[3-4]。然而，高濃度的高級醇使蒸餾酒產(chǎn)生“異味”，飲用之后使人產(chǎn)生頭暈、頭痛的感覺，也就是通常所說的“上頭”。此外，高級醇在人體內的代謝比乙醇緩慢，過量累積也會導致肝損傷[5-6]，對人體健康造成嚴重危害。葡萄蒸餾酒常見的高級醇有正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇5種。因此，對葡萄蒸餾酒中5種高級醇的精準檢測和質量控制顯得尤為重要。

《蒸餾酒及配制酒—衛(wèi)生標準的分析方法》（GB/T 5009.48—2003）中推薦了分光光度法和填充柱氣相色譜法作為高級醇的檢測方法[7]。但兩種方法均有一定的缺陷，分光光度法試驗操作繁瑣，耗時長，試驗中顯色不穩(wěn)定，重現(xiàn)性差，準確度不高[8]；填充柱氣相色譜法采用外標定量法，進樣技術的高低，直接影響著試驗結果的精密度與準確度。因此，本研究采用內標標準曲線法。與外標法相比，該方法不受進樣誤差制約，試驗結果更加準確。

靜態(tài)頂空法是一種間接分析方法，應用于揮發(fā)性、半揮發(fā)性物質的分析。與直接進樣法相比，不存在儀器和色譜柱被污染的風險，還具有操作簡單、易于自動化等優(yōu)點[9]。本研究采用靜態(tài)頂空/氣相色譜-質譜聯(lián)用同時測定葡萄蒸餾酒中正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇5種高級醇含量，旨在為葡萄蒸餾酒的產(chǎn)品質量安全提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津GCMS-QP2010 Ultra及工作站（日本島津），AOC-6000頂空進樣器，電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司），20 mL頂空瓶（瑞士CTC Analytics AG）。

氯化鈉和無水乙醇均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。正丙醇（99.5%）、異丁醇（99.5%）、正丁醇（99.7%）、異戊醇（99%）、正戊（99.5%）和叔戊醇（99.5%）均購自阿拉丁試劑有限公司。1#、2#、3#、4#、5#、6#葡萄蒸餾酒均為本試驗室產(chǎn)品，酒精度分別為65%、60%、55%、65%、60% 、55% Vol。

1.2 GC-MS測定條件

GC條件：色譜柱為RTX-WAX毛細管色譜柱（30 m× 0.25 μm×0.25 mm）；載氣為高純氦氣；分流進樣，分流比為50∶1，進樣口溫度200 ℃；柱溫采用程序升溫：35 ℃保持5 min，再以18 ℃·min-1升至100 ℃，最后以25 ℃·min-1升至150 ℃，恒流模式，流量1.0 mL·min-1

MS條件：色譜-質譜接口溫度250 ℃，離子源溫度200 ℃；電離模式：電子轟擊源（EI），轟擊能量70 eV。選擇離子監(jiān)測待測物質的保留時間、定量離子和定性離子（表1），以叔戊醇為內標物。

表1 選擇離子檢測叔戊醇和5種高級醇的保留時間、定量離子和定性離子Table 1 Values of retention time and quantitative and qualitative ions under SIM mode for tert-amyl alcohol and five high alcohols

1.3 混合標準儲備液和模擬酒樣的配制

樣品空白基質：用無水乙醇和超純水配制體積分數(shù)為60%的乙醇溶液，作為樣品空白基質。

混合標準儲備液：準確稱取正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇各1.0000 g于100 mL容量瓶中，用樣品空白基質溶解并定容，配成質量濃度為10 g·L-1的混合標準儲備液，于4 ℃保存，備用。

模擬酒樣：由樣品空白基質將混合標準儲備液稀釋而成。

1.4 頂空氣相色譜-質譜法試驗過程

取5.0 mL葡萄蒸餾酒樣（提前添加無水乙醇或稀釋成酒度60%）或模擬酒樣于20.0 mL頂空瓶中，加入0.5 g氯化鈉，5 μL叔戊醇作為內標物，用帶硅橡膠膠墊的具有磁力的瓶蓋封閉，放入自動進樣器樣品盤，頂空進樣器設定轉速為250 r·min-1，在55 ℃下攪拌10 min，進樣1000 μL。

2 結果與分析

2.1 頂空條件優(yōu)化

2.1.1 頂空平衡溫度的優(yōu)化

在靜態(tài)頂空進樣中，樣品的平衡溫度將直接影響試驗結果。本試驗考察了平衡溫度分別為40、45、50、55、58 ℃下的目標物峰面積的大小。結果表明，5種高級醇的峰面積隨溫度升高而增大，55 ℃時達到最大，然后峰面積隨溫度升高而減小（圖1）。平衡溫度越高，5種高級醇的蒸氣壓越高，頂空氣體的濃度越高，峰面積越大；另一方面，過高的平衡溫度可能造成待測組分在傳輸管路中的冷凝，導致進樣量變少，峰面積減小[10]，因此，最優(yōu)平衡溫度為55 ℃。

圖1 頂空平衡溫度的優(yōu)化Figure 1 Optimization of headspace equilibrium temperature

2.1.2 頂空平衡時間的優(yōu)化

在頂空過程中，平衡時間是影響試驗結果的重要因素。靜態(tài)頂空試驗是在恒溫平衡狀態(tài)下，通過測定從樣品基質揮發(fā)到頂空瓶上方的揮發(fā)性物質而實現(xiàn)的。

本研究考察了平衡時間為5、10、15、20、30 min時對目標物峰面積的大小的影響。結果表明：平衡時間為10 min時，5種高級醇的峰面積最大（圖2）。因此，適宜的平衡時間為10 min。

圖2 頂空平衡時間的優(yōu)化Figure 2 Optimization of headspace equilibrium time

2.1.3 NaCl添加量的優(yōu)化

靜態(tài)頂空法測定揮發(fā)性有機物時，樣品基體以及電解質的濃度可能影響活度系數(shù)，因此，適當增加液體樣品的離子強度，產(chǎn)生“鹽效應”，可降低5種高級醇在液體樣品中的溶解度，從而影響測定靈敏度[11]，增強目標分析物的響應值。通過考察0、0.5、1.0、1.5 g NaCl添加量，來討論鹽效應對目標分析物峰面積大小的影響。結果表明，當添加0.5 g NaCl時，5種高級醇的峰面積最大，為最佳添加量，見圖3。

圖3 NaCl添加量的優(yōu)化Figure 3 Optimization of the amount of NaCl

2.2 方法學驗證

2.2.1 標準曲線和方法檢出限

取混合標準儲備液，分別用樣品空白基質配制目標分析物濃度為0.08～10 g·L-1的模擬酒樣，添加5 μL 叔戊醇。按照1.4的試驗方法進行測定，質譜掃描方式為SIM模式，定性離子和定量離子的選擇由表1所示，叔戊醇為內標，繪制內標標準曲線，線性方程如表2所示。5種高級醇在0.08～10 g·L-1的濃度范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)（r）在0.9994～0.9999。以3倍信噪比（S/N）計算得到正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇5種高級醇的檢出限在0.25～1.27 mg·L-1。

表2 五種高級醇的線性方程、線性范圍、線性相關系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equation, inear range, r, limit of detection for five high alcohols

2.2.2 準確度與精密度驗證

為考察本研究建立的SH/GC-MS可行性和用于葡萄蒸餾酒中5種高級醇測定時的準確度，對葡萄蒸餾酒進行添加回收試驗。取3種自制的葡萄蒸餾酒（1#、2#、3#），在0.1、0.5、1 g·L-1添加水平下進行加標回收率試驗，每個水平重復3次。結果表明：5種高級醇的添加回收率在80.0%～87.0%，相對標準偏差（RSD，n＝3）小于10%。該方法有較高的準確度和良好的穩(wěn)定性，可用于葡萄蒸餾酒中正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇5種高級醇的檢測。

表3 葡萄蒸餾酒中5種高級醇的測定(n=3)Table 3 Determination of five high alcohols in distilled wine (n=3)

2.3 實際樣品分析

以所建立的SH/GC-MS，對3種葡萄蒸餾酒（4#、5#、6#）中正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇5種高級醇含量進行測定。結果顯示，高級醇總含量分別為1.8486、0.9542、2.1500 g·L-1，見表4。在所選擇3種葡萄蒸餾酒中，正丁醇、正戊醇均未檢測出，說明這3種葡萄蒸餾酒中正丁醇和正戊醇的量低于該方法的檢測限。根據(jù)國家標準GB 2757—1981《蒸餾酒及配制酒衛(wèi)生標準》之前對于高級醇（以異丁醇和異戊醇計）含量要小于2 g·L-1的標準（按60%折算），4#、5#和6#樣品均符合要求。

表4 實際葡萄蒸餾酒樣品的測定Table 4 Determination of actual distilled wine samples g·L-1

3 討論與結論

在蒸餾酒中高級醇起著舉足輕重的作用，若含量過低，酒體不豐滿，口感差；但是含量過高會嚴重影響酒體的協(xié)調性，還會對飲用者的身體健康產(chǎn)生潛在的危害，比如宿醉和嚴重頭痛[12-13]。因此，建立準確可靠的高級醇的檢測方法顯得尤為重要，在蒸餾酒質量安全控制方面發(fā)揮的作用重大。

本試驗所選毛細管柱與國標中填充柱相比較，雖然填充柱出峰時間快，但分離效果較差[14]；而本研究選擇的毛細管柱，在質譜掃描時用SIM方式，完全可以克服上述問題，結果更加準確。目前，有關運用靜態(tài)頂空氣相色譜-質譜法檢測葡萄蒸餾酒中高級醇的相關報道不多。莫燕霞等[15]采用毛細管內標法測定白蘭地中高級醇含量，方法檢出限為2.5 mg·L-1；于洪梅[16]采用固相微萃取與氣相色譜聯(lián)用法分析了啤酒中的5種高級醇，檢出限為2～7 mg·L-1；甄會英等用氣相色譜外標法測定葡萄酒中的高級醇，回收率為95.18%～102.25%；蘆麗等[18]采用靜態(tài)頂空氣相色譜法分析了保健酒中高級醇含量，檢出限為1.4～2.0 mg·L-1。

本文建立了靜態(tài)頂空與氣相色譜質譜聯(lián)用法對蒸餾酒中高級醇進行檢測，通過對頂空平衡溫度、頂空平衡時間和氯化鈉添加量等靜態(tài)頂空條件的優(yōu)化選擇，建立了操作簡單、快速、準確，且不損傷儀器設備的分析方法，用于葡萄蒸餾酒中高級醇的檢測。正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇和正戊醇5種高級醇的檢出限為0.25～1.27 mg·L-1，加標回收率80.0%～87.0%，相對標準偏差均小于10%，在實際樣品分析中具有良好的適用性。