‘玫瑰香’葡萄皮游離態和結合態香氣成分分析

董經崇，胡文效，邱磊，趙先炎，姚彬彬，程傳格，苑金鵬

（1. 齊魯工業大學（山東省科學院）生物工程學院，山東濟南 250353；2. 山東中煙工業有限責任公司技術中心，山東濟南 250014；3. 山東省分析測試中心，山東濟南 250108）

‘玫瑰香’（Muscat Hamburg）葡萄屬于歐亞種，原產英國，由‘黑漢’與‘白玫瑰’雜交育成。果實具有濃郁的玫瑰花香氣，生動優雅，是玫瑰香型葡萄代表品種，也是鮮食和加工兼用品種，1892年引入我國，為我國栽培面積較大、分布較廣的葡萄品種之一。

香氣是評價葡萄和葡萄酒品質的重要指標之一。大量文獻顯示，葡萄漿果中香氣成分以游離態和糖苷結合態的形式存在，并且結合態香氣化合物含量高于游離態。王志群等[1]研究發現，‘雷司令’‘赤霞珠’品種中糖苷結合態α-萜品醇含量是游離態的3～5倍，且果實發育過程中沒有明顯變化。孟楠等[2]在葡萄中確定了許多對葡萄果實香氣有重要貢獻的C13降異戊二烯類化合物，包括β-紫羅蘭酮、β-大馬士酮等，它們由類胡蘿卜素降解產生；結合態糖基化共軛物的大量積累使得這些降異戊二烯類化合物成為非揮發性的無氣味化合物，直到它們在酶或酸水解的作用下被釋放為游離態的降異戊二烯類化合物。

葡萄果實中芳香物質的含量分布為果皮＞果肉＞果汁[3]。本研究旨在通過對‘玫瑰香’果皮中不同存在形式的香氣成分進行定性、定量分析，為探索‘玫瑰香’葡萄皮資源高值利用和減少碳排放提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：‘玫瑰香’葡萄皮。2021年10月上旬，取自蓬萊國賓酒莊‘玫瑰香’漿果經氣囊壓榨分離出的果皮。

試劑：氯化鈉、無水硫酸鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；乙酸苯乙酯（分析純），上海麥克林生化科技有限公司；二氯甲烷（色譜純），美國天地試劑公司；C4～C25正構烷烴（色譜純），北京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

多功能粉碎機，永康市紅太陽機電有限公司；1031型恒溫水浴槽，德國GFL公司；KDM型調溫電熱套，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司；XS104型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；同時蒸餾萃取裝置，天長市康鵬實驗設備有限公司；旋轉蒸發儀，德國海道夫公司；CA-1112型冷卻水循環裝置，東京理化器械株式會社；7890B/7000D氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

參照王霄倩等[4]對葡萄皮渣的干燥方式。取新鮮葡萄皮渣在常溫條件下自然干燥，除去籽，將葡萄皮粉碎至平均粒徑0.28 mm后密封放于4 ℃冰箱中，保存待用。

1.3.2 香氣成分提取

參照張相輝等[5]對津巴布韋煙葉香氣成分的提取方法，經同時蒸餾萃取、旋轉蒸發濃縮提取葡萄皮游離態和結合態香氣成分。

游離態香氣成分萃取：稱取10.0 g樣品置于1000 mL圓底燒瓶中，加入2.0 g NaCl、200 mL的檸檬酸磷酸鹽緩沖溶液（pH 5.5），用電熱套進行加熱，保持微沸；另取50 mL二氯甲烷置于500 mL圓底燒瓶中，加入0.1 mL內標物（1.0 g·L-1乙酸苯乙酯溶液），用水浴槽進行加熱，保持水浴溫度為60 ℃，同時蒸餾萃取2.5 h。完成后取出二氯甲烷瓶，向瓶中加入2.0 g無水硫酸鈉干燥至少2 h，在50 ℃水浴常壓條件下旋轉蒸發至1 mL，待進樣分析。

結合態香氣成分萃取：在樣品瓶中加12.0 mL 濃度為3 mol·L-1的H3PO4溶液，調節緩沖溶液的pH值至2.5；另取50 mL二氯甲烷置于500 mL圓底燒瓶中，加入0.1 mL內標物（1.0 g·L-1乙酸苯乙酯），同時蒸餾萃取2.5 h。完成后取出二氯甲烷瓶，向瓶中加入2.0 g無水硫酸鈉干燥至少2 h，在50 ℃水浴常壓條件下旋轉蒸發至1 mL，待進樣分析。

1.3.3 GC-MS分析條件

GC條件：DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為He；流速1.0 mL·min-1；進樣口溫度為250 ℃；進樣量為1 μL；分流比6∶1；程序升溫：初溫為50 ℃，保持2 min；再以4 ℃·min-1升到170 ℃，保持5 min；再以8 ℃·min-1升到280 ℃，保持10 min。

MS條件：傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；電磁源EI；離子源EI；電離能70 eV；掃描質量范圍30～550 amu；質譜掃描方式：全掃描（SCAN）；溶劑延遲4 min。

1.3.4 定性定量分析

定性分析：參照于立志等[6]定性分析‘巨峰’葡萄香氣成分的方法，采用譜庫檢索結合保留指數（RI）進行鑒定。MS定性：將待定未知物的質譜圖在標準譜庫（NIST14）匹配檢索，保留匹配因子大于80的化合物。RI定性：對C4～C25的正構烷烴標品在相同GC-MS條件下進行分析，根據線性程序升溫保留指數公式計算各化合物的RI，并與該化合物在數據庫（http://www.odour.org.uk/）中采用相同色譜柱的保留指數進行對比，計算公式：

式中：RT為待測組分的保留時間；RTn、RTn+1分別為待測組分保留時間前后正構烷烴的保留時間；n為正構烷烴的碳原子數。

定量分析：參照劉孟龍等定量分析方法[7]，采用內標定量法計算各組分的含量，計算公式：

1.3.5 香氣成分感官屬性分析

依據我國著名調香工作者對香料的香氣分類[8]，參照文獻對香氣成分香氣特征的描述，結合實際將‘玫瑰香’葡萄皮香氣成分按其香氣特征歸入若干個相應的香韻，每種香氣成分可能對應1個或1個以上香韻，每個香韻可包含若干個不同的香氣成分。

計算各香氣成分的氣味活性值（OAV），根據各香韻累計得到的OAV對數值繪制香氣輪廓（1種香氣成分具有多個香韻時，視其對每個香韻的貢獻相同）。OAV是香氣成分含量（C）與水中氣味閾值（OT）的比值[9]，即：

2 結果與分析

2.1 ‘玫瑰香’葡萄皮游離態和結合態香氣成分

‘玫瑰香’葡萄皮游離態和結合態香氣成分如表1所示，游離態香氣成分77種，結合態香氣成分68種。

2.1.1 游離態香氣成分

由表1可知，‘玫瑰香’葡萄皮游離態香氣成分中，27種萜烯類化合物，5種降異戊二烯類化合物，35種脂肪族類化合物，8種芳香族類化合物，2種其它香氣化合物。

27種萜烯類化合物中，萜烯9種（單萜如檸檬烯等3種、倍半萜如β-衣蘭烯等6種）；醇12種（單萜烯醇如芳樟醇等8種、倍半萜烯醇如雪松醇等3種、二萜烯醇植醇）；單萜醛2種（檸檬醛、β-環檸檬醛）；單萜酮1種（二氫香芹酮）；醚3種（單萜醚2種：玫瑰醚、橙花醚；二萜醚：淚柏醚）。淚柏醚在葡萄中罕見報道，在‘玫瑰香’葡萄中為首次發現。它們都源于具有C5基本單元的異戊二烯前體異戊烯基二磷酸（IPP）和二甲丙烯基二磷酸（DMAPP），并且通過甲羥戊酸（MVA）與2-甲基赤蘚糖醇-4-磷酸（MEP）兩條獨立的途徑在植物體中產生[10]。單萜、倍半萜及其衍生物（醇、醛、酮、醚）是對葡萄果實香氣貢獻最大的萜類化合物。

5種降異戊二烯類化合物中6-甲基-5-庚烯-2-酮、6-甲基-3,5-庚二烯-2-酮、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮等源于葡萄類胡蘿卜素降解。葡萄進入成熟期游離態和糖基結合態C13降異戊二烯在果實中積累，催化葡萄類胡蘿卜素裂解的雙加氧酶基因（VvCCD1）的CCD1同源基因已被克隆和鑒定[11]，CCDs能在各種植物類胡蘿卜素的特定雙鍵位置發生裂解[12]。

35種脂肪族類化合物中，醛類化合物13種，包括C6、C7、C8、C9、C10醛，其中不飽和醛10種；酸類化合物8種，其中直鏈脂肪酸6種（長鏈脂肪酸和中鏈脂肪酸各3種），支鏈脂肪酸2種（異戊酸、2-甲基丁酸）；酯類化合物7種，其中脂肪酸乙酯5種（長鏈脂肪酸乙酯2種，中鏈脂肪酸乙酯2種和3-羥基丁酸乙酯），乙酸酯1種（乙酸異戊酯）和脂肪酸甲酯1種；內酯類3種（桃醛、當歸內酯和β-丁內酯）；酮類2種（3-乙酰基-2-丁酮、3-羥基-2-丁酮）；醇類2種（1-辛烯-3-醇和3,5-辛二烯-2-醇）。脂肪族香氣化合物中，醇、醛、酸、酮源于脂肪酸氧化、氨基酸降解，酯類和內酯類是基于醇、酸進一步合成的產物[13]。

8種芳香族類化合物包括苯甲醛、2-苯乙醛2種芳香醛，甲酸香草酯、乙酸苯甲酯2種芳香脂，苯甲醇、2-苯乙醇等3種芳香醇以及1,3,5-三甲氧基苯1種芳香烴。芳香族類化合物大多來源于莽草酸途徑的中間體或芳香族氨基酸代謝次生產物。莽草酸途徑始于D-赤蘚糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的縮合，經過一系列催化反應生成分支酸，分支酸在相關酶的作用下進行色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的合成，其中苯丙氨酸是2-苯乙醇、2-苯乙醛合成的前體物[14]。

2.1.2 結合態香氣成分

結合態香氣成分是指通過糖苷鍵與單糖分子結合的香氣化合物[15]。由表1可知，‘玫瑰香’葡萄皮結合態香氣成分共68種（與游離態共有成分58種），包括25種萜烯類化合物，3種降異戊二烯類化合物，30種脂肪族類化合物，7種芳香族類化合物，3種其它香氣化合物。

表1 ‘玫瑰香’葡萄皮游離態和結合態香氣成分的組成及含量Table 1 Composition and content of free and combined aroma components in 'Muscat Hamburg' grape skin

續表1

續表1

25種萜烯類化合物中，萜烯11種（單萜如氧化檸檬

烯等5種、倍半萜如β-波旁烯等6種）；醇9種（單萜烯醇如脫氫芳樟醇等6種、倍半萜烯醇α-杜松醇等3種）；單萜醛1種（檸檬醛）；單萜酮1種（二氫香芹酮）；醚3種（單萜醚兩種香葉醚、橙花醚和二萜醚淚柏醚）。其中氧化檸檬烯屬于檸檬烯氧化物，由順式和反式結構混合生成，脫氫芳樟醇屬于芳樟醇衍生物，可通過分子重排直接合成檸檬醛或制備紫羅蘭酮[16]。

3種降異戊二烯類化合物為C13香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮和植酮，在游離態中均檢出（含量相對較高）。

30種脂肪族類化合物包括3,5-辛二烯-2-醇1種脂肪醇，庚醛、2-庚烯醛等7種脂肪醛，正己酸、辛酸等9種脂肪酸，3-羥基丁酸乙酯、β-丁內酯、二氫獼猴桃內酯等11種脂肪酯與內酯，3-乙酰基-2-丁酮、3-羥基-2-丁酮兩種脂肪酮。其中辛酸等脂肪酸以C14～C18的游離脂肪酸為前體物質，經過α碳原子羥基化、脫氫、脫羧等一系列途徑后生成脂肪醛，隨后被氧化成少一個碳原子的脂肪酸[17]。

7種芳香族類化合物包括苯甲醛、2-苯乙醛兩種芳香醛，對甲基苯乙酮1種芳香酮，苯甲醇、2-苯乙醇等3種芳香醇以及1,3,5-三甲氧基苯1種芳香烴。

3種其它化合物為5-甲基呋喃醛、糠酸甲酯（游離態不含有）和異戊酸香葉酯，其中糠酸甲酯以糠醛為起始物質，在酸性條件下生成糠酸、進一步酯化反應生成糠酸甲酯[18]，異戊酸香葉酯是異戊酸與香葉醇酯化反應產物。

2.2 游離態與結合態香氣成分含量比較

表1顯示，‘玫瑰香’葡萄皮游離態和結合態共有的香氣成分有58種，其中21種萜烯類、3種降異戊二烯類、26種脂肪族類、6種芳香族類化合物。葡萄皮中化合物的兩種存在狀態含量如圖1。

圖1 葡萄皮中香氣化合物游離態和結合態形式含量Figure 1 Contents of free and bound forms of aroma compounds in grape skin

萜烯類、芳香族類化合物在結合態形式中的含量較高，脂肪族類化合物結合態形式含量略低于游離態，降異戊二烯類化合物結合態形式含量低于游離態。

葡萄皮中各類香氣化合物存在狀態及含量與分子官能團類型有關，醇類、酸類、內酯類化合物結合態含量較高。萜烯類化合物中，萜烯醇類化合物結合態形式含量顯著高于游離態，芳樟醇、氧化芳樟醇、α-松油醇、橙花醇、雪松醇結合態含量分別是游離態的2.16、14.83、3.95、2.18、1.62倍；脂肪族類化合物中，直鏈脂肪酸、內酯類化合物結合態形式含量較高，如異戊酸、正癸酸、月桂酸、桃醛結合態形式含量為游離態的3.01、1.35、2.74、1.68倍；芳香族類化合物中，芳香醇、芳香醛化合物結合態形式含量顯著高于游離態，2-苯乙醇、2-苯乙醛結合態含量分別是游離態的2.06、3.93倍；降異戊二烯類化合物結合態形式含量較游離態低。

2.3 ‘玫瑰香’葡萄皮香氣成分感官屬性

香韻（香氣特征類型）和香勢（香氣活度）是香氣物質的兩個重要感官屬性，是評價香氣物質香氣質與香氣量的兩個重要參量。對‘玫瑰香’葡萄皮檢出的87種香氣成分，對照文獻報道氣味閾值，經計算和統計OAV大于1（對整體香氣有貢獻）的游離態香氣成分33種、游離態加結合態香氣成分34種。參照文獻對香氣成分香氣特征的描述，結合實際將OAV＞1的香氣成分歸入7個香韻類型（花香、青香、木香、果香、甜香、辛香、脂蠟香），如表2。

表2 ‘玫瑰香’葡萄皮中香氣成分屬性Table 2 Properties of aroma components in 'Muscat Hamburg' grape skin

由表2可知，對葡萄皮香氣量有貢獻的33種游離態香氣成分中，萜烯類12種，占36.36%；降異戊二烯類4種，占12.12%；脂肪族類13種，占39.39%；芳香族類4種，占12.12%。不同類別香氣成分對葡萄皮整體香氣量貢獻度：萜烯類4.38%，降異戊二烯類27.77%，脂肪族類67.60%，芳香族類0.25%。

游離態加結合態香氣成分34種，其中萜烯類13種，降異戊二烯類4種，脂肪族類13種，芳香族類4種。假設通過技術手段將葡萄皮結合態香氣成分釋放出來，并對葡萄皮香氣成分進行提取，單位質量葡萄皮提取物OAV較游離態提取物OAV理論上可增加32.62%；預測萜烯類、降異戊二烯類、脂肪族類、芳香族類化合物對提取物整體香氣的貢獻度分別為7.74%、34.87%、56.49%、0.9%。萜烯類、降異戊二烯類、芳香族類香氣成分對整體香氣貢獻度有大幅度增加，脂肪族類香氣成分貢獻度有所減少。

表2顯示，不同種類香氣成分具有各自的香韻特征，每個香韻的強度由多種香氣成分貢獻。根據表2，把7個香韻作為7個坐標，將每個坐標上香氣成分OAV對數值加和，將得到的7個點連線，形成葡萄皮整體香氣輪廓，圖2。

圖2實線顯示，‘玫瑰香’葡萄皮游離態香氣7個香韻依次為果香＞花香＞青香＞脂蠟香＞木香＞甜香＞辛香，主體香韻為果香、花香、脂蠟香。假設葡萄皮中結合態香氣成分通過降解完全釋放，依據本項分析結果表1、表2，預測‘玫瑰香’葡萄皮香氣或提取物香氣輪廓如圖2虛線所示，果香＞花香＞青香＞脂蠟香＞木香＞甜香＞辛香，香韻強弱次序與游離態相比雖沒發生變化，但整體香氣量大幅增加，并且花香、果香、青香、木香是整體香氣量增加的主要貢獻者，香韻結構比例發生了較大變化，主體香韻為果香、花香、青香。

圖2 ‘玫瑰香’葡萄皮中香氣成分香氣輪廓Figure 2 Aroma profiles of aroma components in Muscat grape skin

3 結論與討論

通過SDE-GC-MS法對‘玫瑰香’葡萄皮香氣成分進行提取和分析，共檢測出77種游離態香氣成分、68種結合態香氣成分，游離態和結合態共有的香氣成分有58種，僅以游離態形式存在的化合物有19種，僅以結合態形式存在的化合物有10種。萜烯醇、芳香醇、脂肪酸等化合物結合態形式含量高于游離態，2-苯乙醇、芳樟醇、α-松油醇總體含量最高；C13降異戊二烯類化合物游離態高于結合態。這表明‘玫瑰香’葡萄多數香氣化合物以游離態和結合態兩種形式存在，醇、酸類化合物主要以結合態形式存在；同時表明，成熟后的‘玫瑰香’葡萄糖苷結合態香氣化合物水解酶相對缺失，類胡蘿卜素雙加氧裂解酶（CCDs）可能仍保持活性。

本研究在‘玫瑰香’葡萄皮中發現“淚柏醚”且含量較高，表明‘玫瑰香’葡萄具有高表達合成淚柏醚合成酶的特性，這為葡萄皮蛋白組學、淚柏醚生物合成研究提供了信息。表1中的5-甲基呋喃醛、糠酸甲酯、異戊酸香葉酯可能是樣品前處理過程中化學反應產物。

通過對‘玫瑰香’葡萄皮香氣成分感官屬性分析，葡萄皮呈果香、花香、青香、脂蠟香，并帶有木香、甜香和辛香香韻，33種游離態香氣成分對整體香氣有貢獻，對香氣量貢獻度大小依次為脂肪族類、降異戊二烯類、萜烯類和芳香族類。‘玫瑰香’葡萄皮結合態香氣成分（潛在香氣成分）主要是果香、花香和青香香韻的萜烯類和降異戊二烯類化合物。

葡萄酒行業每年生產大量葡萄皮渣[23-24]，目前我國對葡萄皮渣的利用仍停留在簡單的粗加工層面，通常被當作肥料、飼料甚至垃圾處理[25]，利用價值低。在葡萄皮渣中，果皮約占皮渣濕重的50%～82%，其中含有多種有機質并具有一定的功能性生物價值[26]，對葡萄果皮進行綜合處理利用，可從中提取出花色苷、白藜蘆醇、酚酸等酚類物質以及酒石酸，還可對葡萄果皮再次發酵進行醋、酵素的釀造[27]。根據本文研究，‘玫瑰香’葡萄皮中含有豐富的優質香氣成分如含氧單萜、倍半萜和C13降異戊二烯等化合物；含有較高濃度的“淚柏醚”生物活性成分，并可能含有雙加氧裂解酶（CCDs）有待探索。所以，‘玫瑰香’葡萄皮是一種重要的生物基資源。其作為香氣物質資源，將葡萄皮通過酶技術或微生物技術處理，使結合態香氣成分充分釋放出來[28]，利用現代方法分離出香氣物質，應用于食品、化妝品等日用消費品生產，實現葡萄皮高值利用，不但具有經濟意義，而且對降低生物碳排放具有重要生態意義。