聯氨基姜黃素對大鼠肝癌的防護作用及其機制

趙冀安 崔麗敏 馬艷榮 董梁 聶文佳 劉文聰 劉維麗

(1河北醫科大學第一醫院普通外科，河北 石家莊 050013；2定州市人民醫院腫瘤內科；河北醫科大學第一醫院 3急診科；4醫務處；5超聲科；6肝膽外科)

肝癌是人類最主要的惡性腫瘤之一〔1〕。由于診斷和治療技術的進步，在早期發現肝癌時，可以通過手術切除，射頻消融(RFA)和經導管動脈化療栓塞(TACE)等進行治療。然而，肝癌的頻繁復發往往會阻礙治療〔2〕，因為剩余的肝臟仍有致癌的可能〔3〕。通過回顧性研究發現常用的化療(全身化療、介入栓塞化療等)對肝癌患者的總體療效不佳，并不能提高患者生存率〔4〕。姜黃素(CUR)是姜黃的有效成分，在臨床試驗中對肝癌、結腸癌、乳腺癌等癌癥有很強的抗腫瘤作用〔5,6〕。盡管CUR具有顯著的無毒性和良好的抗癌活性，但有研究表明，由于其在生理條件下的不穩定性和生物利用度較低，限制了其在抗癌治療中的應用〔7,8〕。為了保留CUR良好的藥用特性和安全性，同時提高其藥效，合成了一種CUR吡唑類似物，即聯氨基CUR(HZC)，并應用于多種腫瘤細胞。Rathore等〔9〕通過一種有效的高效液相色譜法(HPLC)，同時測定腸灌注液中的HZC和酚紅的不同pH值，發現HZC具有良好的腸道通透性。既往研究證實HZC對于多種癌細胞具有細胞毒性，尤其是HepG2細胞，在所有CUR類似物中，其半數有效量(ED50)值最低〔10〕。Wang等〔11〕研究發現，HZC能有效抑制信號轉導和轉錄活化因子(STAT)3磷酸化程度，降低STAT3下游相關基因的表達，可抑制乳腺癌細胞增殖和促進其凋亡。DEN已經確定是大鼠肝癌發生的強力藥物，在該致癌因子的作用下，通過自身細胞的突變、轉化和增殖形成的大鼠肝癌與人肝癌的發生過程相似〔12〕。SD大鼠與人肝癌的相似性已被廣泛接受，使其成為肝癌研究的理想模型〔13〕。本文探討HZC對二乙基亞硝胺(DEN)誘導的大鼠肝癌發生和發展的影響，并探究其發生機制。

1 材料與方法

1.1材料 由河北醫科大學動物中心提供4 w齡雄性SD大鼠(體重100～110 g)80只。大鼠在恒溫(23℃)和恒濕(55%)的12 h光/暗循環的通風室中，使其適應動物房的條件，并在24 w的整個實驗期間，喂飼市售顆粒大鼠飼料和水。DEN、兔抗增殖細胞核抗原(PCNA)抗體購自美國Sigma公司；谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBL)試劑盒均購自羅氏公司。

1.2動物分組及給藥方法 根據需要將大鼠隨機分為：正常對照組〔腹腔注射生理鹽水(80 mg/kg)〕、藥物對照組〔腹腔注射HZC(80 mg/kg)〕、模型組〔腹腔注射DEN(50 mg/kg)〕、干預組〔腹腔注射DEN(50 mg/kg)和HZC(80 mg/kg)〕。以上4組均給藥2次/w，12 w后停藥。待24 w實驗結束。

1.3觀察與方法 實驗持續24 w，每周末記錄體重，實驗結束時按照動物倫理準則對所有存活的大鼠進行麻醉并處死。處死前通過心臟穿刺從所有組中采集血樣。將血樣以3 000 r/min離心3 min，然后分離血清并保持在-20℃，直到用于生化分析。采用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST、ALP、GGT、TBL水平。測量大鼠體重和肝臟重量，并計算肝臟指數(肝重/體重×100%)統計腫瘤數量。切取各組肝臟標本。病理學觀察：肉眼觀察肝臟大體形態,結節大小。鑒于大鼠肝癌多為分散的癌結節，致使計數腫瘤容易出現紕漏。根據相關文獻的統計方法，本文將腫物直徑大于6 mm的結節認定為肝癌〔12〕。剪取的肝組織用甲醛溶液固定后脫水，56℃石蠟包埋，制備常規切片，進行蘇木素-伊紅(HE)染色。肝癌的診斷和分級是根據細胞塊切片上的形態學發現確定的。增殖細胞核抗原(PCNA)定位于細胞核，陽性呈棕黃色，顆粒狀或彌漫性分布。表達強度取決于染色強度(0：陰性；1：弱；2：中；3：強)和陽性細胞百分比(0：0%陽性細胞；1：≤25%陽性細胞；2：26%～50%陽性細胞；3：>50%陽性細胞)。兩數相加，最高分數為6分。評分>2分表示標志物的免疫組化認定為陽性。

1.4統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行χ2檢驗、方差分析或秩和檢驗。

2 結 果

2.1各組一般情況比較 正常對照組和藥物對照組大鼠體重增長較快，無死亡。隨著實驗進行，模型組、干預組大鼠飲水和進食開始減少，精神萎靡，毛發干燥，體重增加緩慢且小于正常對照組和藥物對照組，但干預組上述癥狀較模型組輕。實驗結束，兩個對照組均無死亡。模型組死亡12只，干預組死亡2只，經病理確診為肝癌。正常對照組、藥物對照組均未發生肝癌。模型組和干預組肝癌發病率分別為100.0%和20.0%。模型組平均癌結節數目〔(17.17±1.08)個〕較干預組〔(11.83±3.90)個〕明顯增多(P<0.05)。兩個對照組及二者與干預組體重、增重、肝重和肝臟指數均無顯著差異(均P>0.05)。與兩個對照組相比，模型組體重、增重明顯降低，肝重和肝臟指數明顯增高(P<0.05)。與模型組相比，干預組體重、增重明顯升高，肝重、肝臟指數明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組體重、增重、肝重及肝臟比較

2.2各組形態學改變 兩個對照組肝臟表面正常，邊緣銳利，色澤紅潤，沒有出現增生結節。模型組邊緣不整齊，色澤灰白暗淡，可見表面出現大小不等的灰白色癌結節，質地較硬，結節切面有壞死及出血。干預組肝臟也可見白色癌結節，但與模型組相比，癌結節數量明顯減少，且結節直徑較小，見圖1。

圖1 各組肝臟形態改變

2.3各組組織病理學改變 正常對照組肝小葉結構完整，細胞無變性壞死，細胞核清晰，肝索規整，且圍繞中央靜脈呈放射狀排列；藥物對照組顯示出中央靜脈和肝血竇輕到中度充血；模型組肝小葉結構嚴重紊亂，細胞變性，結構消失，細胞核分裂及胞質內分泌顆粒增多，有大小不等的再生結節；干預組同模型組比較，肝小葉結構紊亂和肝細胞變性程度較模型組明顯減輕，肝癌細胞排列相對有序，部分癌灶呈現片狀壞死，見圖2。

2.4各組免疫組化結果 正常對照組和藥物對照組肝組織中幾乎沒有出現PCNA陽性細胞；模型組PCNA蛋白陽性率為70.0%，核深染，提示細胞分裂和增殖旺盛；干預組PCNA蛋白陽性率(13.3%)，與兩個對照組(0.0%、0.0%)比較顯著上升，但較模型組顯著下降(P<0.05)，見圖3。

2.5各組肝功能檢測 模型組和干預組的ALT、AST、ALP、GGT、TBL指標明顯高于兩個對照組(P<0.05)。干預組的各項肝功能指標較模型組明顯降低(P<0.05)。兩個對照組肝功能指差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

圖2 各組肝臟組織HE染色(×400)

表2 各組ALT、AST、ALP、GGT和TBL水平比較

3 討 論

肝臟是大多數化學物質、藥物和致癌物質代謝的主要器官〔14〕。有研究報道，給予DEN的大鼠食物攝取減少和隨后的體重增重減少可能由于骨骼肌和脂肪組織的丟失，甚至蛋白質消耗引起的〔15〕。有實驗報道同對照組相比，給予DEN的大鼠體重顯著減少，而肝臟重量會顯著增加是由于肝臟癌結節〔16〕，與本研究結果一致。

PCNA是一種細胞增殖活性標志物，可用來反映腫瘤細胞核惡性程度，分化越差指標越高〔17〕。PCNA表達增強提示肝組織增生異常。本研究結果提示DEN可明顯誘導肝癌的發生發展，而HZC對DEN誘導的大鼠肝癌模型的發生具有防護作用。

DEN導致的肝臟損傷一般會影響肝細胞功能，肝細胞受損使血清酶釋放入血而出現升高改變〔18〕。ALT、AST、ALP、GGT和TBL是反映肝功能損害的敏感指標〔19〕。ALT反映肝細胞損傷最為敏感，即使輕微肝功能損傷，數值也會抬高，而且通常伴隨AST升高〔20〕。ALP與管狀區的脂質膜密切相關，不管是肝內還是肝外的損害都會導致ALP活性升高〔21〕。GGT是一種膜結合酶，一般位于膽管內上皮細胞和肝細胞滑面內質網中，是肝膽疾病的敏感指標之一。GGT在血清中增高可能由于這種酶從細胞膜中釋放至血液循環中，提示致癌物導致細胞膜損害〔22〕。當發生肝癌時，大鼠血清中GGT顯著升高是因為該酶從質膜釋放到循環系統中，表明由于致癌作用導致細胞膜受損。TBL反映肝細胞損害程度和預后，其增高可能是由于致癌劑的毒性作用損害了肝細胞和竇內皮細胞，致使中央靜脈周圍的網狀結構塌陷產生出血而形成的〔23〕。這與本研究一致。通過使用HZC治療使這些酶活性較模型組降低，表明HZC保護了細胞膜的完整性，從而降低酶泄漏。提示HZC通過降低ALT、AST、ALP、GGT和TBL活性對肝臟有保護作用。

環氧化酶(COX)-2是COX的一種主要類型，與肝硬化、肝癌的發生發展關系密切，其在肝硬化、肝癌患者肝組織中的表達均高于正常肝組織〔24〕。COX-2被證明通過免疫反應抑制、凋亡抑制、血管生成調節和腫瘤細胞侵襲來影響致癌作用，在癌癥發生發展過程中起到關鍵作用〔25〕。研究發現腫瘤組織COX-2過度表達的患者預后較差〔26〕。研究表明，在許多腫瘤中COX-2過度表達可抑制腫瘤細胞凋亡，而COX-2抑制劑可誘導腫瘤細胞發生凋亡。COX-2是預防和治療炎癥性疾病和癌癥的重要靶基因。COX-2啟動子區域包括2個核轉錄因子(NF)-κB結合位點，CUR通過干擾NF-κB激活抑制COX-2表達，從而預防癌癥的發生〔27〕。Selvam等〔28〕設計了一系列的CUR衍生物，發現吡唑類衍生物HZC具有對COX-2的抑制、抗氧化和抗炎活性，該研究結果表明，HZC較CUR相比，COX-2的選擇性顯著增強，并具有明顯的抗炎活性，吡唑環取代CUR的β-二酮片段可顯著提高COX-2的選擇性。原因是HZC含有2個甲氧基，其抗COX-2活性能力高于CUR。本研究認為HZC作用的分子機制可能是通過抑制NF-κB通路及減少COX-2中NF-κB調控基因的表達來實現的。提示HZC通過抑制COX-2的表達來干擾NF-κB的活性，因此具有較好的抗腫瘤活性。

綜上，HZC降低了DEN對大鼠肝臟的毒性，從而降低了DEN的發生率、腫瘤數量、肝臟重量、肝臟指數、肝臟標志酶，增加了生存率和體重。證實HZC對DEN誘導的SD大鼠肝癌具有防護作用，但其作用機制仍需進一步探究。