過表達miR-122-5p通過靶向調控NOD2對帕金森病模型細胞損傷的保護作用及其機制

王倩 王羅俊 顧然 田甜 李亞騏 瞿祥 龍光文 涂麗 蔡立君 田錦勇

(1貴州省人民醫院神經內科，貴州 貴陽 550002；2中國人民解放軍空軍軍醫大學附屬西京醫院神經內科；3貴州省人民醫院急診內科；貴州醫科大學附屬醫院 4全科醫學科；5神經內科)

帕金森病(PD)高發于老年人群，其臨床表現為運動遲緩、姿勢平衡障礙等，目前關于多巴胺神經元細胞凋亡的機制尚未完全闡明〔1〕。因而如何抑制神經元細胞凋亡成為治療PD的關鍵環節。研究表明顱腦損傷后微小RNA-122-5p(miR-122-5p)的表達下調，其可能通過促使p53表達上調而促進神經細胞凋亡〔2〕。miR-122在大鼠肝損傷中呈低表達，上調miR-122對肝細胞化學性損傷發揮保護作用〔3〕。但miR-122-5p在PD模型細胞損傷中的作用機制尚未完全闡明。Targetscan預測miR-122-5p的靶基因，預測顯示核苷酸結合寡聚化結構域(NOD)2可能是miR-122-5p的靶基因，研究表明NOD2在6-羥基多巴胺(OHDA)誘導的PD動物模型中呈高表達，敲除NOD2可減輕神經元損傷〔4〕。腎缺血再灌注損傷小鼠腎組織中NOD2表達水平升高，抑制NOD2信號通路可減輕炎癥反應而減輕腎損傷〔5〕。NOD2高表達還可促進潰瘍性結腸炎的發生及發展，抑制NOD2表達可減輕結腸黏膜炎癥〔6〕。腦缺血后腦組織中NOD2的表達上調，下調NOD2的表達可對局灶性腦缺血發揮保護作用〔7〕。但miR-122-5p是否通過調控NOD2的表達影響PD細胞的損傷尚未可知。因此本研究主要探討miR-122-5p是否通過調控NOD2基因而抑制MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 SH-SY5Y細胞購自美國ATCC細胞庫。1-甲基-4苯基-吡啶離子(MPP+)購自美國Sigma公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；Trizol、逆轉錄及實時熒光定量(qRT)PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；RIPA蛋白裂解液購自美國Sigma公司；Lipofectamine2000購自北京索萊寶科技有限公司；miR-122-5p mimics、miR-122-5p抑制劑(anti-miR-122-5p)、NOD2小干擾RNA(si-NOD2)及其各自陰性對照購自廣州銳博生物科技公司；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程；二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購自北京碧云天生物有限公司；NOD2、Bax、Bcl-2抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2實驗分組 用1 mmol/L的MPP+誘導SH-SY5Y細胞建立PD模型(MPP+組)，未經處理的SH-SY5Y細胞作為Con組〔8〕，將SH-SY5Y細胞隨機分為： MPP++miR-NC組(miR-NC轉染SH-SY5Y細胞48 h，隨后用1 mmol/L的MPP+處理24 h)、MPP++miR-122-5p組(miR-122-5p mimics轉染SH-SY5Y細胞48 h，隨后用1 mmol/L的MPP+處理24 h)、MPP++si-NC組(si-NC轉染SH-SY5Y細胞48 h，隨后用1 mmol/L的MPP+處理24 h)、MPP++si-NOD2組(si-NOD2轉染SH-SY5Y細胞48 h，隨后用1 mmol/L的MPP+處理24 h)、MPP++miR-122-5p+pcDNA組(miR-122-5p mimics與空載體pcDNA共轉染SH-SY5Y細胞48 h，隨后用1 mmol/L的MPP+處理24 h)、MPP++miR-122-5p+pcDNA-NOD2組(miR-122-5p mimics與pcDNA-NOD2共轉染SH-SY5Y細胞48 h，隨后用1 mmol/L的MPP+處理24 h)。

1.3qRT-PCR檢測細胞中miR-122-5p、NOD2 mRNA表達水平 收集各組細胞，加入1 ml Trizol，細胞裂解后轉移至1.5 ml無菌無酶的EP管內，室溫放置10 min，加入200 μl氯仿，振蕩混勻，室溫孵育5 min，4℃ 12 000 r/min轉速離心15 min，吸取上清轉移至另一無菌無酶的EP管內，加入200 μl異丙醇，室溫靜置10 min，4℃ 12 000 r/min轉速離心10 min，棄上清，加入預冷乙醇，反復沖洗后晾干，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解沉淀，應用紫外分光光度計測定RNA質量。參照反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，配制qRT-PCR體系：SYBR Green 預混液15 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O補足體系至25 μl。反應條件：95℃預變性2 min，變性、退火及延伸：40個循環(95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s)。miR-122-5p以U6為內參，NOD2 以GAPDH為內參，置于96孔板熒光定量PCR儀進行擴增反應，反應結束后得到Ct值，采用2-ΔΔCt法計算miR-122-5p、NOD2 mRNA相對表達量。

1.4測定MDA、GSH含量 收集各組細胞，采用比色法檢測MDA、GSH含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 分別取各組轉染后SH-SY5Y細胞，按照細胞凋亡檢測試劑盒進行操作，預冷PBS洗滌細胞，取1×106個細胞加入200 μl結合緩沖液重懸，加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl的PI，充分混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μl結合緩沖液重懸至流式管內，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6雙熒光素酶報告基因實驗 SH-SY5Y細胞以每孔3×103個細胞的密度接種于96孔板，常規培養12 h，按照Lipofectamine2000轉染試劑盒說明書，每孔共轉NOD2的3'-非翻譯區(UTR)熒光素酶報告基因(40 ng)或其突變載體、pRL-TK熒光素酶內參質粒(10 ng)及終濃度為20 nmol/L的miR-122-5p mimics，以miR-NC為對照，轉染24 h，應用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性。

1.7Western印跡檢測NOD2、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)蛋白表達 SH-SY5Y細胞處理后分別收集各組細胞，加入細胞裂解液裂解細胞，采用BCA法測定蛋白濃度，取30 μg蛋白樣品進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用含有牛血清白蛋白(BSA)的Tis-HCl緩沖液(TBST)封閉1 h，加入NOD2、Bax、Bcl-2抗體(1∶500)，4℃孵育24 h，TBST洗膜，加入二抗(1∶2 000)，室溫杜宇1 h，TBST洗膜，滴加ECL顯影，應用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.8統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗，方差分析。

2 結 果

2.1miR-122-5p和NOD2在MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷中的表達 與Con組相比，MPP+組SH-SY5Y細胞中miR-122-5p表達水平顯著降低，NOD2 mRNA及蛋白表達水平顯著升高(均P<0.001)，見表1、圖1。

2.2miR-122-5p靶向調控NOD2的表達 Targetscan預測miR-122-5p的靶基因，miR-122-5p可靶向NOD2的3'UTR區，見圖2。為驗證miR-122-5p是否靶向作用于NOD2，構建NOD2的熒光報告基因載體及突變體載體后，共轉染NOD2的3'UTR熒光素酶報告基因載體與miR-122-5p mimics，結果顯示，miR-122-5p可抑制NOD2的3'UTR熒光素酶報告基因的活性(P<0.05)，而當miR-122-5p的結合位點突變后，miR-122-5p對NOD2的3'UTR熒光素酶報告基因活性的抑制作用消失，見表2。

表1 miR-122-5p和NOD2在MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷中的表達

圖1 Western印跡檢測NOD2蛋白

圖2 NOD2的3'UTR中含有與miR-122-5p互補的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

采用Western印跡檢測結果顯示，SH-SY5Y細胞中轉染miR-122-5p mimics后，與miR-NC組(0.43±0.04)相比，miR-122-5p組NOD2蛋白表達水平顯著降低(0.22±0.02，P<0.05)；而SH-SY5Y細胞中轉染anti-miR-122-5p后，與anti-miR-NC組(0.41±0.05)相比，anti-miR-122-5p組NOD2蛋白表達水平顯著升高(0.89±0.08，P<0.05)，見圖3。

1～4：miR-NC組，miR-122-5p組，anti-miR-NC組，anti-miR-122-5p組圖3 miR-122-5p靶向調控NOD2的表達

2.3miR-122-5p過表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的影響 與Con組比較，MPP+組SH-SY5Y細胞中MDA含量明顯升高，而GSH含量明顯降低，細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，Bax蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05)，進一步研究顯示，與MPP++miR-NC組相比，MPP++miR-122-5p組SH-SY5Y細胞中MDA含量明顯降低，GSH含量明顯升高，細胞凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)，見表3、圖4、圖5。

2.4抑制NOD2表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的影響 與MPP++si-NC組比較，MPP++si-NOD2組SH-SY5Y細胞中MDA含量明顯降低，GSH含量明顯升高，細胞凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，Bax蛋白表達水平顯著降低(均P<0.05)，見圖6、表4。

表3 miR-122-5p過表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的影響

圖4 miR-122-5p過表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞凋亡的影響

1～4:Con組,MPP+組，MPP++miR-NC組，MPP++miR-122-5p組圖5 Western印跡檢測凋亡相關蛋白表達

1～4：Con組，MPP+組，MPP++si-NC組，MPP++si-NOD2組圖6 NOD2和凋亡相關蛋白表達

表4 抑制NOD2表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的影響

2.5NOD2過表達逆轉了miR-122-5p過表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的作用 與MPP++miR-122-5p+pcDNA組比較，MPP++miR-122-5p+pcDNA-NOD2組SH-SY5Y細胞NOD2蛋白表達、凋亡率、MDA含量與Bax蛋白表達水平均顯著升高，而GSH含量及Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低(均P<0.05)，見表5、圖7。

表5 NOD2過表達逆轉了miR-122-5p過表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的作用

1～4：miR-NC組，miR-122-5p組，miR-122-5p+pcDNA組，miR-122-5p+pcDNA-NOD2組圖7 NOD2和凋亡相關蛋白表達

3 討 論

miRNA可通過結合mRNA的3'UTR區序列而負性調控基因表達進而參與神經退行性疾病等多種病理過程〔9,10〕。研究表明炎癥因子釋放量增加可損傷多巴胺神經元，既往研究發現PD發病機制與多巴胺氧化產生的毒性代謝物、細胞凋亡及炎癥反應等密切相關〔11〕。

miR-122-5p在黑色素瘤組織中高表達，并可通過誘導細胞周期阻滯而抑制細胞增殖〔12〕。miR-122-5p在不同病理類型或不同組織中的表達及其可能作用機制不同，研究表明miR-122-5p在四氯化碳誘導的急性肝損傷大鼠中表達下調，上調miR-122-5p表達可有效改善大鼠肝臟損傷〔13〕。miR-122-5p在膝骨關節炎中的表達水平降低，其低表達量與疾病嚴重程度呈負相關〔14〕。本研究結果說明miR-122-5p表達降低可能加重MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷。GSH屬于抗氧化酶類并可有效降低氧化應激反應從而防止脂質過氧化引起的神經元凋亡〔15〕。PD疾病發生過程中Bcl-2與Bax可介導神經元細胞凋亡、細胞質性細胞死亡等過程，研究表明Bcl-2過表達或Bax低表達可減少神經元細胞的凋亡〔16〕。說明PD模型細胞中的氧化應激反應被激活，抗氧化應激能力降低，神經元細胞凋亡增加，而miR-122-5p過表達可明顯提高細胞抗氧化能力及抗凋亡能力。提示miR-122-5p過表達可改善MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷，對SH-SY5Y細胞發揮保護作用。

本研究結果證實NOD2是miR-122-5p的靶基因，miR-122-5p可負性調控NOD2表達，其中NOD2屬于NOD家族成員，并可在多種炎癥性疾病或免疫疾病中發揮重要作用，研究表明NOD2在PD發生過程中可能發揮重要作用〔17〕。NOD2可通過調控多種信號通路參與炎癥反應、氧化應激反應等多種病理過程，研究表明敲除NOD2基因可通過減少炎癥因子生成量而改善糖尿病小鼠腎損傷〔18〕。相關研究報道指出，敲除NOD2基因可通過減少TNF-α等炎性細胞因子釋放及促進Bcl-2蛋白表達而保護PD小鼠神經元〔19〕。提示miR-122-5p可能通過調控NOD2基因表達而保護PD模型細胞。進一步研究發現，抑制NOD2表達后，MPP+誘導SH-SY5Y細胞氧化應激水平降低，細胞凋亡能力受到抑制，而NOD2過表達可逆轉miR-122-5p過表達對MPP+誘導SH-SY5Y細胞損傷的保護作用。提示miR-122-5p過表達可靶向抑制NOD2表達及增強抗氧化能力從而對MPP+誘導的SH-SY5Y細胞損傷發揮保護作用。

綜上所述，MPP+誘導SH-SY5Y細胞模型中，miR-122-5p表達下調，NOD2表達上調，miR-122-5p過表達可通過靶向NOD2抑制細胞凋亡及增強其抗氧化能力，對PD模型細胞損傷發揮保護作用，可為PD治療提供新方向。