沙庫巴曲纈沙坦鈉片通過NF2/Mst1信號通路抑制細胞凋亡改善心肌梗死大鼠心肌纖維化

向長鐵 劉佳麗 張愛民 吳倩 聶連桂 劉茂軍 楊軍

(1南華大學附屬第一醫院心內科，湖南 衡陽 421001；2常德市石門縣人民醫院)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是導致人類疾病死亡的主要原因之一，據推算我國現有冠心病患者1 100萬〔1〕。而心肌梗死為導致死亡及不良預后的最常見的原因，尤其心肌梗死后往往出現明顯的心功能不全，故嚴重影響了心肌梗死的長期預后，而心肌重構是其發生發展的關鍵環節。心肌梗死后心肌細胞可出現細胞凋亡、壞死，正常心肌細胞數量減少，間質膠原纖維增多，導致心肌負性重構。現有研究表明細胞凋亡是心肌梗死后心肌重構的重要機制〔2〕。而神經纖維蛋白(NF)2/哺乳動物不育系20樣激酶(Mst)1信號通路在多項研究中已被證實可以促進心肌細胞凋亡〔3～6〕，Dalal等〔4〕研究顯示，在心肌梗死大鼠模型中，異丙腎上腺素(Iso)可翻譯修飾NF2激活Hippo信號通路通過線粒體死亡途徑參與心肌細胞凋亡，相反NF2/Mst1活化受阻，則抑制細胞凋亡。 沙庫巴曲纈沙坦鈉片(諾欣妥，Lcz696)是由腦啡肽酶抑制劑沙庫巴曲和血管緊張素受體抑制劑纈沙坦(Vdt)組成一種抗心力衰竭藥物，目前已有多項研究證明，諾欣妥具有心血管保護和抗心肌重構作用〔7～9〕。研究證實，Lcz696可以通過抑制促炎性細胞因子、基質金屬蛋白酶(MMP)9及醛固酮的生成等在心肌梗死中發揮心肌保護作用〔9〕。但其否通過MF2/Mst1信號通路抑制細胞凋亡保改善梗死后心肌纖維化目前尚不清楚。本實驗通過建立異丙腎上腺素致大鼠心肌梗死模型，研究Lcz696能否通過NF2/Mst1信號通路抑制細胞凋亡改善心肌梗死后心肌纖維化。

1 材料與方法

1.1材料 40只雄性SD大鼠，體重(220±20)g，于南華大學動物實驗中心處購買，保證水源和食物充足，在室溫(23±1)℃下分籠喂養，晝夜更替為12 h，適應性喂養1 w。

1.2主要試驗試劑 Iso(大連美侖公司)；Lcz696(瑞士Novartis Pharma Schweiz AG公司)；Vdt(海南皇隆制藥股份有限公司)；NF2、Mst1等一抗(美國Proteinch公司)；一抗甘油醛-3磷酸脫氫酶(GAPDH，晶欣生物公司)；羊抗兔二抗(武漢博士德公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒及細胞裂解液(碧云天公司)。

1.3動物模型的建立及分組 大鼠經適應性喂養1 w后，隨機分成4組，對照組(Control組)、模型組(Iso組)、Lcz696干預組(Iso+Lcz696組)和Vdt干預組(Iso+Vdt組)，后3組經腹腔注射Iso〔50 mg/(kg·d)〕共2次，Control組同時腹腔注射等量生理鹽水2次，通過檢測心電圖和肌鈣蛋白確定模型建立成功，然后Iso+Lcz696組每日分別予以Lcz696(60 mg/kg)灌胃，Iso+Vdt組每日分別予以Vdt(30 mg/kg)灌胃，Control組和Iso組每日分別予以等量的蒸餾水灌胃。共干預4 w。

1.4Masson染色觀察各組心肌膠原沉積 取出甲醛浸泡的心臟組織，過氧化氫沖洗，乙醇脫水，石蠟包埋后，再使用刀片切取4 μm左右組織，脫蠟直至水化，再使用蘇木素染色8～10 min，沖洗，再通過1%鹽酸-酒精分色，沖洗，接著采用麗春紅酸性品紅液染色5～10 min，沖洗，予1%磷鉬酸水溶液處理5 min后再經苯胺藍液染色5 min，然后置于1%冰醋酸中浸泡1 min，最后再次予以梯度酒精脫水，透明，置于光鏡下觀察。

1.5Western印跡檢測相關蛋白表達 取各組大鼠左心室組織樣本，研磨均勻后加入細胞裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液后裂解10 min，離心提取上清液，通過BCA比色法進行蛋白定量，然后再通過制膠、電泳、轉膜和封閉后，用稀釋好的GAPDH、NF2、Mst1、B淋巴細胞瘤(Bcl)-2、半胱天冬酶(Caspase)9的一抗在4℃下孵育24 h，TBST溶液漂洗3次后，再用稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗在37℃下孵育1 h，TBST漂洗3次，避光下在裝有BIO-ID的顯影儀器上顯影，經圖像分析后，獲取目的條帶，通過與GAPDH的灰度對比來表示蛋白表達水平。

1.6統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組大鼠存活情況 干預結束后存活大鼠36只，Control組10只，Iso組9只，Iso+Lcz696組9只，Iso+Vdt組8只。大鼠死亡原因與心肌梗死后心肌損傷或心力衰竭有關。

2.2各組大鼠心電圖分析 建模后檢測各組大鼠心電圖變化，Iso組、Iso+Lcz696組和Iso+Vdt組大鼠建模成功后心電圖對比Control組，Ⅱ導聯T波高聳，ST段呈弓背向上抬高。見圖1。

2.3各組大鼠血漿肌鈣蛋白檢測 建模后檢測抽取的尾部靜脈血，檢測各組大鼠肌鈣蛋白值變化，Control組、Iso組、Iso+Lcz696組和Iso+Vdt組大鼠血漿肌鈣蛋白水平分別為：(30.17±6.99)pg/ml、(376.12±49.72)pg/ml、(385.22±61.99)pg/ml、(383.54±41.36)pg/ml，Iso組、Iso+Lcz696組和Iso+Vdt組血漿肌鈣蛋白水平與Control組相比均有明顯升高(P<0.05)。

2.4各組大鼠心肌組織Masson染色結果 Masson染色觀察心肌組織膠原沉積，沉積膠原纖維為藍染。與Control組相比，Iso組藍色區域明顯增多，膠原纖維沉積明顯。與Iso組相比，Iso+Lcz696組藍色區域顯著減少，膠原纖維沉積顯著減少。而Iso+Lcz696組與Iso+Vdt組相比，心肌膠原纖維沉積顯著減少。見表1、圖2。

圖1 各組大鼠心電圖結果

表1 各組膠原纖維占比及Caspase9、Bcl-2、NF2、Mst1蛋白表達水平比較

圖2 各組心肌組織Masson染色(×400)

2.5各組心肌組織Caspase9、Bcl-2、NF2和Mst1等蛋白表達 與Control組相比，Iso組心肌組織中Caspase9蛋白表達顯著上調(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達顯著下調(P<0.05)。與Iso組相比，Iso+Lcz696組和Iso+Vdt組大鼠心肌組織中Caspase9表達顯著下調(P<0.05)，而Iso+Lcz696組Bcl-2的蛋白表達顯著上調(P<0.05)，Iso+Vdt組Bcl-2表達則上調不明顯(P>0.05)。同時與Control組相比，Iso組心肌組織中NF2、Mst1的蛋白表達顯著上調(P<0.05)。與Iso組相比，Iso+Lcz696組和Iso+Vdt組NF2、Mst1的蛋白表達顯著下調(P<0.05)，但Iso+Lcz696組與Iso+Vdt組相比NF2、Mst1的蛋白下調更明顯(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織Caspase9、Bcl-2、NF2、Mst1蛋白表達結果比較

3 討 論

心肌梗死后出現的心肌重構是決定患者長期預后的關鍵環節〔10〕，而心肌細胞凋亡則是其中的重要病理機制〔11〕。本實驗通過以腹腔注射Iso 2 d建立大鼠心肌梗死模型〔12～14〕。建模后對照組及干預組心電圖T波高聳，ST段成弓背上抬，肌鈣蛋白較正常組明顯升高。確定模型建立成功。同時Masson染色顯示心肌梗死大鼠存在明顯心肌纖維化，Iso組大鼠心肌組織Caspase9明顯上調，而Bcl-2的表達下調，提示心肌梗死后心肌重構可能與心肌細胞凋亡增加有關。

NF2是埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ezrin/radixin/moesin，ERM)家族的成員，一種促凋亡激酶，能夠調節細胞胞內和胞外信號傳遞。Mst1是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在心肌損傷中易被激活〔5〕。NF2/Mst1信號通路在心肌細胞更新和心臟修復作用中起著重要作用〔4〕。有研究表明，在心肌缺血再灌注損傷模型中，NF2激活磷酸化后，可激活Mst1，促進心肌細胞凋亡〔15〕。另有研究顯示，Iso可誘導NF2/Mst1的表達增加，NF2/Mst1的失活可增加心肌梗死后心肌細胞數量，減少瘢痕形成，改善心功能，而NF2/Mst1上調可通過線粒體死亡途徑，促進心肌細胞凋亡〔4〕。本研究提示，NF2/Mst1激活誘發的細胞凋亡可能參與心肌梗死后心肌重構發生機制。

諾欣妥是近年來在心力衰竭治療領域廣泛應用的新藥，已有研究顯示Lcz969可通過抑制鳥嘌呤核苷酸結合蛋白改善心臟重構〔4〕。另有研究顯示，Lcz696通過降低糖尿病小鼠心肌纖維化改善心臟功能，可能與沙庫巴曲的作用有關〔16～20〕。Lcz696可以減輕心肌梗死后心肌纖維化，原因可能是由沙庫巴曲和Vdt共同作用所致〔5〕。本研究提示Lcz696可能通過NF2/Mst1信號通路通過抑制心肌細胞凋亡來改善心肌梗死后大鼠心肌纖維化；Lcz696改善心肌重構的作用可能沙庫巴曲和Vdt共同作用所致，其抑制心肌梗死后心肌纖維化的作用可能與抑制NF2/Mst1介導的細胞凋亡有關。以上研究為進一步探討梗死后心肌重構發生機制及干預策略提供了初步的實驗依據。