廣西三江縣侗族新生兒UGT1A1基因變異分析

姚璇 鐘丹妮 彭運(yùn)聰

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，廣西南寧 530021；2.三江縣人民醫(yī)院兒科，廣西柳州 545500）

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（uridine diphosphate‐glucuronosyl transferase，UGT） 是1 種重要的Ⅱ相藥物代謝酶，UGT大家族中的UGT1是由染色體2q37 的1個(gè)UGT1 位點(diǎn)編碼，包含了第1外顯子（A1‐A13）和4個(gè)共同外顯子（2～5），分別組成9 種亞型，UGT1A1 是其中1 種，并且目前研究發(fā)現(xiàn)UGT1A1是參與調(diào)控膽紅素結(jié)合反應(yīng)唯一的關(guān)鍵酶［1-2］。UGT1A1基因發(fā)生突變，可能會(huì)導(dǎo)致酶活性降低甚至消失，使膽紅素正常代謝過(guò)程受阻，膽紅素積聚而引起新生兒高膽紅素血癥［3］。UGT1A1變異可能存在人種和地區(qū)差異。柳州三江縣是多民族聚居地，以侗族為主，并且新生兒高膽紅素血癥發(fā)病率較高。本研究通過(guò)檢測(cè)三江縣侗族新生兒熱門基因變異位點(diǎn)，了解三江縣侗族新生兒UGT1A1基因變異情況，探討UGT1A1基因變異與三江縣侗族新生兒不明原因高未結(jié)合膽紅素血癥的關(guān)系，以便為當(dāng)?shù)匦律鷥狐S疸病因診斷及治療提供更多遺傳學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

前瞻性選取2021 年1 月至2022 年1 月于三江縣人民醫(yī)院新生兒科診斷不明原因高膽紅素血癥的新生兒84 例為研究對(duì)象。其中男51 例，女33例；胎齡≥37 周，日齡2～14 d；出生體重2.5～4.0 kg；三代純系侗族。根據(jù)2014年制定的《新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專家共識(shí)》［4］，當(dāng)總膽紅素值大于相應(yīng)小時(shí)齡的膽紅素光療值，以間接膽紅素增高為主，可診斷高膽紅素血癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：ABO或Rh血型不合所致溶血性疾病、葡萄糖‐6‐磷酸脫氫酶缺乏、紅細(xì)胞增多癥、嚴(yán)重?cái)⊙Y、頭顱血腫等體內(nèi)出血、低出生體重兒、小于胎齡兒、早產(chǎn)兒、巨大兒、圍生期缺氧窒息、低血糖、甲狀腺功能減退、地中海貧血者予以排除。另選取同期在三江縣人民醫(yī)院產(chǎn)科出生的健康新生兒60例納入健康對(duì)照組，其中男36例，女24例；胎齡≥37周，日齡2～14 d；出生體重2.5～4.0 kg；三代純系侗族。住院觀察3～5 d 后出院并隨訪至生后2周，膽紅素水平未達(dá)到“光療”標(biāo)準(zhǔn)。該研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021KY‐E‐286）。

1.2 DNA提取

取兩組新生兒外周血2 mL 以EDTA 抗凝，用血液基因組DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取基因組DNA，置-20℃保存。

1.3 PCR反應(yīng)及電泳鑒定

根據(jù)課題組前期研究設(shè)計(jì)上游引物：5'‐GTCACGTGACACAGTCAAAC‐3'，下 游 引 物：5'‐AAGTAGGAGAGGGCGAACC‐3'［5］，擴(kuò)增片段主要為UGT1A1啟動(dòng)子區(qū)TATA 盒和外顯子1 的DNA 片段，片段長(zhǎng)度999 bp。

PCR 體 系（總 體 積50 μL）： 2×Es Taq MasterMix 25 μL，上下游引物各2 μL，DNA 模板500 ng，無(wú)酶水補(bǔ)充至50 μL。PCR 程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30 次；72℃再延伸2 min。產(chǎn)物置于4℃保存。

2%瓊脂糖凝膠用Ⅰ型核酸染料染色，以DNA Marker 為分子量參照物，取PCR 產(chǎn)物5 μL，電壓120 V，電泳30 min。利用生物電泳圖像分析系統(tǒng)觀察DNA 電泳條帶。不符合要求的PCR 產(chǎn)物重新提取血液DNA，直至獲得電泳結(jié)果符合要求。

1.4 基因測(cè)序

經(jīng)電泳檢測(cè)過(guò)的所有合格的PCR 產(chǎn)物，送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行正向測(cè)序。應(yīng)用Chromas軟件分析測(cè)序結(jié)果，測(cè)序結(jié)果比對(duì)基因文庫(kù)的UGT1A1基因序列，觀察波形，發(fā)現(xiàn)有堿基變異點(diǎn)的產(chǎn)物重新進(jìn)行反向測(cè)序，以確保結(jié)果真實(shí)可靠。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率（%）或例數(shù)表示，對(duì)兩組等位基因頻率、基因型頻率比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法；logistic回歸方程分析基因變異對(duì)新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的影響因素；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SHEsis在線分析平臺(tái)進(jìn)行Hardy‐Weinberg平衡檢驗(yàn)［6］，P＞0.05為符合遺傳平衡。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

經(jīng)PCR 擴(kuò)增后得到的UGT1A1啟動(dòng)子區(qū)TATA盒和外顯子1 的DNA 片段產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果呈單一條帶，PCR 擴(kuò)增片段與目的片段長(zhǎng)度（999 bp）相符，見圖1。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 M為Marker；右側(cè)白色條帶為UGT1A1啟動(dòng)子區(qū)TATA盒和外顯子1的DNA擴(kuò)增片段（999 bp）。

2.2 一般情況

病例組與健康對(duì)照組的出生體重、胎齡、性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 兩組新生兒一般資料比較

2.3 UGT1A1基因突變觀察結(jié)果

第1 外顯子區(qū)：在病例組中觀察到G71R 雜合突變30 例，純合突變3 例，突變頻率為39%（33/84）；在健康對(duì)照組觀察到雜合突變12 例，無(wú)純合突變，突變頻率為20%（12/60）。兩組均為錯(cuò)義突變，具體情況詳見圖2。

圖2 UGT1A1 G71R（c.211G＞A）位點(diǎn)測(cè)序圖 箭頭所示為堿基突變位點(diǎn)。

2.4 兩組UGT1A1 基因突變類型分布及等位基因頻率分析

病例組UGT1A1G71R的AG基因型頻率顯著高于健康對(duì)照組（P=0.022），病例組UGT1A1G71R的A 等位基因頻率顯著高于健康對(duì)照組（P=0.010），見表2。

表2 兩組UGT1A1 G71R基因型及等位基因頻率的比較 ［例（%）］

2.5 UGT1A1 基因多態(tài)性對(duì)柳州三江縣新生兒高膽紅素血癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

以是否發(fā)生高膽紅素血癥為因變量，是否發(fā)生UGT1A1G71R 突變?yōu)樽宰兞浚M(jìn)行二元logistic回歸分析，結(jié)果顯示G71R錯(cuò)義突變是新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的危險(xiǎn)因素，提示帶有G71R錯(cuò)義突變（AA/AG）的新生兒發(fā)生高膽紅素血癥的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶野生型（GG） 健康新生兒的2.588 倍（95%CI：1.199～5.586）。

2.6 UGT1A1 基因G71R 位點(diǎn)的Hardy‐Weinberg平衡檢驗(yàn)

Hardy‐Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示病例組和健康對(duì)照組的UGT1A1G71R 位點(diǎn)基因型均符合Hardy‐Weinberg 平衡（P＞0.05），說(shuō)明人群代表性好，該基因位點(diǎn)基因型在研究人群中符合遺傳平衡。

3 討論

膽紅素是一種脂溶性激素，難溶于水，必須經(jīng)過(guò)肝臟生物轉(zhuǎn)化處理增加其水溶性再由膽汁等排出體外，UGT1A1是參與膽紅素代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶，其基因5'端的第1外顯子編碼氨基末端，決定酶底物的特異性，3'端是4個(gè)共同外顯子，編碼羧基末端，是酶與膽紅素-尿苷二磷酸葡萄糖醛酸結(jié)合的位點(diǎn)。整個(gè)基因如果有發(fā)生變異，有可能會(huì)影響基因編碼的酶活性，從而影響膽紅素代謝，最終出現(xiàn)黃疸。截至目前，全球已發(fā)現(xiàn)163個(gè)變異位點(diǎn)［7］。此外，單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)變異對(duì)于mRNA穩(wěn)定性、氨基酸序列及酶的表達(dá)可能也存在影響。UGT1A1基因變異可能還具有人種和地區(qū)性差異。在高加索人種中，以羅馬尼亞和俄羅斯為例，UGT1A1變異以啟動(dòng)子TATA 盒突變?yōu)橹鳎謩e有（TA）5、（TA）7和（TA）8［8-9］，而在黃種人中，例如中國(guó)和日本，UGT1A1變異則以G71R 突變?yōu)橹鳎?0-11］。除人種外還存在地區(qū)因素，例如同樣在亞洲大陸，地處南亞的印度UGT1A1變異主要表現(xiàn)為啟動(dòng)子TATA 盒突變［12］，而在東亞的韓國(guó)則主要表現(xiàn)為G71R突變［13］。

G71R 突變?yōu)閁GT1A1基因第1 外顯子上的211位堿基出現(xiàn)G＞A 突變，使原編碼的氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼幔瑢?dǎo)致UGT1A1葡萄糖醛酸化效率下降至野生型的47%［14］。本研究中病例組的G71R突變頻率（39%）高于廣西來(lái)賓地區(qū)（37.4%）［5］及那坡壯族地區(qū)（28.0%）［10］，略低于云南丘北少數(shù)民族縣（45%）［15］，說(shuō)明G71R 是三江縣侗族新生兒高頻突變位點(diǎn)。病例組的A 等位基因頻率（21%）顯著高于健康對(duì)照組（10%）。上述結(jié)果均提示本研究人群UGT1A1基因的G71R 錯(cuò)義突變與侗族新生兒膽紅素水平升高有關(guān)。另外Zhang等［16］的研究中侗族人群G71R 突變頻率則是18.9%，A等位基因頻率為9.9%，也進(jìn)一步證實(shí)相同民族在不同地區(qū)基因突變頻率不同，這點(diǎn)可能是環(huán)境與遺傳因素共同作用的結(jié)果。結(jié)合logistic 回歸分析可認(rèn)為UGT1A1G71R 突變型是廣西侗族新生兒發(fā)生高未結(jié)合膽紅素血癥的危險(xiǎn)因素，攜帶突變體的侗族新生兒對(duì)高未結(jié)合膽紅素血癥有易感性。Hardy‐Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)的結(jié)果提示該位點(diǎn)各基因型在研究人群中符合遺傳平衡，可能與該地區(qū)侗族提倡族內(nèi)通婚（非近親婚配）有關(guān)，加上三江縣處于重山之中，自古交通往來(lái)不便，減少了與外來(lái)基因的交流，提示侗族G71R突變體的遺傳背景較為原始，遺傳信息上可能出現(xiàn)了遺傳穩(wěn)定性；另外在某些環(huán)境下，雜合子攜帶者或許比野生型攜帶者更適合當(dāng)前的生存環(huán)境，這也可能是三江縣侗族新生兒中G71R雜合突變頻率較高的原因。因此G71R 錯(cuò)義突變成為當(dāng)?shù)囟弊錟GT1A1遺傳的高頻突變類型。

本次研究主要在UGT1A1啟動(dòng)子區(qū)域及第1 外顯子，其余區(qū)域未涉及到，至于侗族新生兒是否存在其他高頻基因變異，有待擴(kuò)大樣本進(jìn)行下一步研究。本文研究的三江縣純系侗族新生兒UGT1A1基因變異情況對(duì)今后該地區(qū)制定UGT1A1高頻突變位點(diǎn)遺傳檢測(cè)和新生兒高膽紅素血癥發(fā)生早診斷、早治療有一定指導(dǎo)作用。