鹽炙車前子多糖抗痛風性腎病作用研究

彭東輝 ，張志宏 ，王洋洋 ，孫延平，曾元寧 ，，王秋紅 ，匡海學

（1.黑龍江中醫藥大學/教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006）

車前子為車前科車前PlantagoasiaticaL.或平車前PlantagodepressaWilld.的干燥成熟種子[1]，主要含有苯乙醇苷、黃酮、環烯醚萜和多糖等成分，具有清熱、利尿、通淋、明目的功效[2]。現代藥理研究發現車前子提取物對痛風有一定的治療效果，能夠顯著降低患者的血尿酸（UA）水平，同時抑制炎癥因子的分泌[3-5]。車前子炮制方法歷史悠久，如《幼幼集成》中“青鹽水炒七次”。現代炮制規范和藥典中，關于車前子炮制方法的一般有3種，即凈制、炒制和鹽炙。車前子鹽炙后，能引藥下行而入腎經，泄熱利尿而不傷陰，增強車前子的泄熱利尿作用[1，6-7]。

痛風性腎病是由于體內UA產生過多或排泄減少，血UA水平長期處于過飽和狀態，尿酸結晶沉積于腎臟的腎髓質、間質以及遠端集合管，最終導致腎實質性病變，臨床主要表現有水腫、尿結石、多尿、夜尿、血、尿UA升高、高血壓及腎小管的功能性損害等[8]。車前子多糖具有免疫調節功能，抗氧化和降尿酸作用[9-11]，但目前關于鹽炙車前子多糖的研究很少。因此，本研究采用水提醇沉法提取鹽炙車前子多糖，并采用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、考馬斯亮藍法和PMP衍生化法，對多糖進行初步研究；采用腺嘌呤和酵母聯用的方法制備痛風性腎病模型大鼠，來研究鹽炙車前子多糖的抗痛風性腎病作用，為開發治療痛風的新型、有效、低毒藥物提供依據[12]。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

5～6周齡SPF級SD雄性大鼠60只，購于廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2018-0002，體質量（200±20）g，適應性喂養1周后開展實驗。

1.2 藥物與試劑

藥材：車前子藥材產地江西（批號YCB0F000 1），經中藥學院李書淵教授鑒定為車前科車前PlantagoasiaticaL.的干燥成熟種子。

試劑：牛血清白蛋白（批號224V055），北京博奧拓達科技有限公司；考馬斯亮藍G-250（批號626M035），天津市光復精細化工研究所；咔唑（批號C10196252），美國 Sigma公司；葡萄糖（Glc批號CHB180929）、巖藻糖（Fuc批號CHB1800602）、阿拉伯糖（Ara批號 CHB180206）、半乳糖（Gal批號CHB180227）、鼠李糖（Rha批號CHB190217）、木糖（Xyl批號CHB180301）、甘露糖（Man批號CHB180615）等單糖標準品均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均不低于98%；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（批號C10661531），上海麥克林生化科技有限公司；三氟乙酸（批號76-05-1），上海阿拉丁生化科技有限公司；腺嘌呤（批號A6279），Macklin公司；酵母干粉（批號050090），廣東環凱微生物科技有限公司；別嘌醇片（國藥準字H34021248），合肥久聯制藥有限公司；尿蛋白定量試劑盒（批號C035-2-1）、尿素氮（BUN）測試盒（批號C013-2）、UA檢測試劑盒（批號C012-2）、肌酐（CRE）測定試劑盒（批號C011-2-1），南京建成生物工程研究所；濃硫酸、苯酚、95%乙醇等試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 主要儀器

UV-1800紫外可見分光光度儀（日本島津公司）；N1300旋轉蒸發儀（東京理化株式會社）；98-1-B調溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）；H1750R高速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；ME104電子分析天平（梅特勒-托利多國際貿易有限公司）；X-15R臺式離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Epoch-2酶標儀（美國Bio-Rad公司）；ACQUITYArc超高效液相色譜儀、2489 UV紫外檢測器、SunFire 5 μm 4.6×250 mm C18反向柱（美國Waters公司）。

2 方法

2.1 鹽炙車前子多糖的提取

取鹽炙車前子500 g，先醇提3次，將醇提后的車前子按照料液比（g∶mL）1∶10，熱水回流提取3次，每次2 h，過濾，合并提取液，減壓濃縮，4℃條件下醇沉過夜，連續醇沉3次，將所得醇沉部分，無水乙醇和丙酮交替洗3次，低溫烘干，即得鹽炙車前子多糖。

2.2 鹽炙車前子多糖總糖、糖醛酸、蛋白含量測定

采用苯酚-硫酸法[13]、硫酸-咔唑法[14]、考馬斯亮藍法[15]，測定車前子多糖中總糖、糖醛酸、蛋白的含量。

定量稱取105℃干燥1 h的葡萄糖標準品，配制成質量濃度為0.04 mg/mL的標準品溶液。精密量取葡萄糖標準品溶液0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6及1.8 mL分別置于10 mL具塞試管中，加雙餾水補充至2.0 mL，再分別加入6%苯酚試劑1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，搖勻后常溫放置5 min，水浴加熱15 min，取出，冷卻至室溫（25℃）。另取蒸餾水2.0 mL，作空白對照，在490 nm處測定吸光度值（A）。同法操作3次，以Glc含量（μg）為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。精確定量稱取鹽炙車前子多糖，配制成濃度為0.08 mg/mL的樣品溶液，按上述測定方法操作，平行測量3次，通過回歸方程計算多糖的葡萄糖含量。

精密定量稱取半乳糖醛酸對照品，配制成質量濃度為0.2 mg/mL的半乳糖醛酸標準品溶液。精密吸取半乳糖醛酸標準品溶液0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 mL，置于10 mL具塞刻度試管中，加水至1.00 mL，另取1.00 mL水作為空白對照，每管中加入濃硫酸5.00 mL，搖勻后，水浴加熱25 min，取出，冷卻到室溫。再加0.1%咔唑乙醇溶液0.20 mL，搖勻，于沸水條件下水浴加熱10 min，取出，冷卻至室溫，加入濃硫酸至10.00 mL，搖勻，在530 nm波長處測定吸光度值。同法操作3次，以半乳糖醛酸含量（μg）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。精確定量稱取鹽炙車前子多糖，配制成2.0 mg/mL的鹽炙車前子多糖樣品溶液，按上述步驟操作，平行測量3次，依據回歸方程計算多糖的糖醛酸含量。

精密定量稱取牛血清白蛋白BSA-Ⅴ，配制成質量濃度為0.1 mg/mL的牛血清白蛋白BSA-Ⅴ溶液。精密吸取 BSA-Ⅴ溶液 0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，加入到10 mL具塞刻度試管中，補充水至1.00 mL，另取1.00 mL水作為空白對照，每管加入5 mL考馬斯亮藍染液，30℃恒溫條件下水浴5 min，取出冷卻，在595 nm處測定各管的吸光度。同法操作3次，以牛血清白蛋白BSA-Ⅴ（μg）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。精確稱取鹽炙車前子多糖，配制成2.0 mg/mL的鹽炙車前子多糖樣品溶液。按上述步驟操作，平行測量3次，依據回歸方程計算多糖的蛋白含量。

2.3 鹽炙車前子多糖單糖組成分析

采用PMP柱前衍生超高效液相色譜法對鹽炙車前子多糖進行單糖組成分析[16]。

2.3.1 多糖水解 取多糖樣品10 mg，置于10 mL具塞試管中，加入2 mol/L三氟乙酸（TFA）溶液2 mL，加蓋密封，于120°C水解160 min，取出放置室溫，減壓蒸餾除去TFA，期間加入甲醇，反復蒸餾3～4次至無酸味，加入雙蒸水2.0 mL溶解。

2.3.2 多糖衍生化 取配置好的標準單糖對照品，混合單糖對照品1.0 mL，分別置于5.0 mL離心管中，依次加入 500 μL 0.5 mol/L PMP 甲醇溶液和 500 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，70°C水浴加熱60 min，室溫放置10 min；再加入500 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，混勻后加入等體積的乙酸異戊酯萃取2次，氯仿萃取1次，取上層（甲醇-水相）過有機濾膜，供UPLC進樣分析。液相方法：0～10～25～30 min，B相：20%～23%～24%～30%乙腈，D相：0.1%甲酸水，柱溫35℃，檢測波長254 nm。

2.4 痛風性腎病大鼠模型的建立、給藥及取材

痛風性腎病模型建立[4,12,17]：大鼠適應性喂養后，隨機挑選10只作為空白組，其余大鼠分為模型組、陽性藥組、鹽炙車前子多糖低、中、高劑量組，每組10只，建立痛風性腎病大鼠模型，采用酵母和腺嘌呤聯用的方法，給藥劑量分別為腺嘌呤100 mg/(kg·d)、酵母10 g/(kg·d)，給藥體積為10 mL/kg；連續造模給藥28 d。

給藥：實驗開始后，除空白組外，各組大鼠上午灌胃給予腺嘌呤和酵母混懸液，下午灌胃給予陽性藥（別嘌醇）和鹽炙車前子多糖，給藥劑量參考2020年版《中國藥典》，結合人與大鼠給藥折算比例換算，確定車前子多糖低、中、高劑量組分別為0.135 g/(kg·d)、0.270 g/(kg·d)、0.540 g/(kg·d)，陽性藥組別嘌醇的給藥劑量為50 mg/(kg·d)，其余兩組給予相同體積蒸餾水，連續給藥28 d。

取材：分別于實驗正式前、實驗開始后的第7天、14天、21天、28天，收集大鼠24 h尿液，4℃，3 000 r/min離心10 min去除沉淀，取上清分裝于ep管中。實驗進行28 d后，各組大鼠麻醉后，腹主動脈取血，快速取大鼠雙腎拍照并稱質量。取右腎置于組織固定液中固定。大鼠血液在4℃，3 000 r/min的條件下，離心15 min，取上清液（血清），分裝于不同規格的ep管中，尿液和血清均置于-80℃冰箱中保存。

2.5 腎表觀特征

28 d后，麻醉取血，快速取大鼠雙腎，觀察表觀特征并取雙腎置于白紙上拍照記錄。稱重，計算腎質量指數。

大鼠的腎質量指數=（雙腎質量/大鼠體質量）×100%。

2.6 腎組織病理學

固定液中的腎組織，石蠟包埋并切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡（×100）下觀察腎組織病理變化。

2.7 24 h尿蛋白及血生化檢測

取離心后的各組血清，按照UA、CRE、BUN這3種試劑盒說明書的具體操作步驟，來檢測其含量。將各組大鼠的24 h尿液，按尿蛋白定量試劑盒說明書的步驟方法，檢測各個時間段各組大鼠尿液的24 h尿蛋白水平。

2.8 統計學處理

實驗數據以xˉ±s表示，采用SPSS22.0統計軟件對數據進行統計分析。組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 鹽炙車前子多糖的提取

按上述方法提取得到鹽炙車前子多糖，其中多糖得率為10.90%。

3.2 鹽炙車前子多糖總糖、糖醛酸、蛋白含量測定結果

采用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、考馬斯亮藍法，測定車前子多糖中總糖、糖醛酸、蛋白的含量，得到葡萄糖標準曲線的回歸方程為Y=0.007 2x+0.030 5（R2=0.999 3）、半乳糖醛酸標準曲線的回歸方程為Y=0.002x+0.032 2（R2=0.999 5）、蛋白標準曲線的回歸方程為Y=0.004 7x-0.0075（R2=0.999 7）；經過計算，鹽炙車前子多糖中總糖含量為32.27%，糖醛酸含量為30.71%，蛋白質的含量為3.46%。

3.3 鹽炙車前子多糖單糖組成分析結果

采用PMP柱前衍生化法，測得7種單糖標準品的標準曲線分別是：Rha：Y=5E+08x+205 889（R2=0.999 5）、Gal：Y=5E+08x+249 206（R2=0.999 8）、Glc：Y=5E+08x+252 490（R2=0.999 8）、Ara：Y=6E+08x-139 516（R2=0.999 9）、Xyl：Y=6E+08x+212 922（R2=0.9997）、Fuc：Y=5E+08x+107768（R2=0.9999）、Man：Y=5E+08x+3E+06（R2=0.999 0）。鹽炙車前子多糖主要由 Man、Rha、Gal、Glc、Ara、Xyl、Fuc組成，通過標準曲線計算可知其摩爾比為Man∶Rha∶Gal∶Glc∶Ara∶Xyl∶Fuc=1.07∶1.49∶5.46∶14.94∶14.34∶42.86∶3.63，由此可知，鹽炙車前子多糖主要由Glc、Ara和Xyl組成，是阿拉伯木聚糖，與文獻報道[18-20]一致。

3.4 腎表觀特征

如圖1所示，空白組大鼠雙腎腎臟組織體積正常，表面呈紅褐色，雙腎表皮平滑，未見任何異常（圖1-A）。模型組大鼠腎臟體積顯著增大，表面可見十分密集的小白點，呈石斑樣，伴有充血和水腫（圖1-B）。陽性藥組大鼠腎臟體積增大，表面充血，出現水腫，偶見小白點（圖1-C）。多糖低劑量組大鼠腎臟體積增大，表面可見小白點，有水腫和充血（圖1-D）。多糖中劑量組大鼠腎臟體積增大不明顯，表面可見稀疏小白點，有輕微充血（圖1-E）。多糖高劑量組大鼠腎臟體積基本無增大，表面呈紅褐色，偶爾可見小白點，基本無水腫和充血（圖1-F）。

圖1 鹽炙車前子多糖對痛風性腎病大鼠雙腎表觀特征的影響Figure 1 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on the apparent characteristics of both kidneys in gouty nephropathy rats

3.5 腎質量指數

由表1可知，與空白組比較，模型組腎質量指數明顯增大，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，多糖高劑量組腎質量指數降低十分明顯，差異有統計學意義（P＜0.01），陽性藥組和多糖中劑量組腎重指數降低明顯，差異有統計學意義（P＜0.05）。結果提示陽性藥別嘌醇、多糖中、高劑量均能降低痛風性腎病模型大鼠的腎質量指數。

表1 鹽炙車前子多糖對痛風性腎病大鼠腎質量指數的影響Table 1 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on renal weight index in rats with gouty nephropathy(±s,n=10)

表1 鹽炙車前子多糖對痛風性腎病大鼠腎質量指數的影響Table 1 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on renal weight index in rats with gouty nephropathy(±s,n=10)

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組陽性藥組多糖低劑量組中劑量組高劑量組劑量/（mg·kg-1）--5 0 135 270 540腎質量指數/%0.70±0.03 1.67±0.20**1.44±0.09#1.54±0.19 1.48±0.07#1.33±0.18##

3.6 腎組織病理學

如圖2所示，空白組大鼠右腎腎組織結構正常，腎小球形態正常，腎小管上皮細胞排列較為整齊，無炎癥細胞浸潤現象（圖2-A）。模型組大鼠右腎腎組織產生顯著病變，腎小球數目減少，腎小管上皮細胞有水腫現象，腎組織中隨處可見大量尿酸鹽結晶，炎癥細胞大量浸潤，并伴有腎間質纖維化（圖2-B）。陽性藥別嘌醇給藥組與空白組比較，有較輕程度的腎組織病變，尿酸鹽結晶減少，有一定程度的炎癥細胞浸潤，伴有輕微的腎間質纖維化（圖2-C）。多糖低劑量組呈現稍微有點明顯的腎組織病變，有較多尿酸鹽結晶，有一定程度的炎癥細胞浸潤，伴有腎間質纖維化（見圖2-D）。多糖中劑量組呈現一定程度的腎組織病變，有一定量的尿酸鹽結晶，有一定程度的炎癥細胞浸潤，伴有一定程度的腎間質纖維化（圖2-E）。多糖高劑量組呈現輕微程度的腎組織病變，偶見少量的尿酸鹽結晶，有輕微的炎癥細胞浸潤，基本無腎間質纖維化現象（圖2-F）。

圖2 鹽炙車前子多糖對痛風性腎病大鼠腎組織病理結構的影響Figure 2 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on renal pathological structure of gouty nephropathy rats

3.7 24 h尿蛋白及血生化檢測

由表2可知，實驗前，各組大鼠24 h尿蛋白水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。造模7 d后，與空白組比較，模型組的尿蛋白水平有一定的升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；造模14 d后，模型組的尿蛋白水平顯著升高，與空白組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；造模21 d后，與空白組比較，模型組24 h尿蛋白水平，持續升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；陽性藥組、多糖高劑量組與模型組比較，24 h尿蛋白含量有所降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；造模28 d后，模型組24 h尿蛋白水平與空白對照組相比，差異有統計學意義（P＜0.01）；陽性藥組、多糖中、高劑量組24 h尿蛋白水平顯著降低，與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 鹽炙車前子多糖對痛風性腎病大鼠24 h尿蛋白水平的影響Table 2 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on 24-hour urinary protein level in rats with gouty nephropathy(±s,n=10)

表2 鹽炙車前子多糖對痛風性腎病大鼠24 h尿蛋白水平的影響Table 2 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on 24-hour urinary protein level in rats with gouty nephropathy(±s,n=10)

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組陽性藥組多糖低劑量組中劑量組高劑量組劑量/（mg·kg-1）24 h尿蛋白/（mg·L-1）--5 0 135 270 540 0 d 27.50±6.44 26.13±3.46 26.10±4.09 25.73±6.98 26.46±3.50 24.09±6.17 7 d 24.77±8.59 41.54±11.76 34.68±8.47 39.26±8.89 36.87±7.62 33.25±8.07 14 d 24.97±7.06 63.55±5.88**54.53±6.98 56.53±6.76 54.84±7.49 49.66±11.15 21 d 29.08±4.37 90.34±10.02**74.09±6.09#84.39±11.50 76.25±11.38 72.86±8.97#28 d 27.48±5.65 122.94±14.94**84.47±6.00##102.90±8.68 78.40±10.53##68.60±10.56##

由表3可知，模型組血清中UA、CRE、BUN水平顯著升高，與空白組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）；陽性藥組、多糖中、高劑量組血清中UA、CRE、BUN水平降低，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 鹽炙車前子多糖對痛風性腎病大鼠血清中UA、CRE和BUN水平影響Table 3 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on the levels of UA,CRE and BUN in serum of gouty nephropathy rats(±s,n=10) c/(μmol·L-1)

表3 鹽炙車前子多糖對痛風性腎病大鼠血清中UA、CRE和BUN水平影響Table 3 Effect of salt-processed Plantain seeds polysaccharides on the levels of UA,CRE and BUN in serum of gouty nephropathy rats(±s,n=10) c/(μmol·L-1)

與空白組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白組模型組陽性藥組多糖低劑量組中劑量組高劑量組劑量--5 0 135 270 540 UA 74.52±11.30 142.42±31.54**93.94±20.58##115.15±24.16 87.88±20.77##82.83±30.70##CRE 56.05±10.58 106.59±26.58**80.82±13.88#85.75±25.43 80.58±6.97#71.58±7.84##BUN 18.27±3.01 47.75±6.44**35.90±4.91##38.98±7.48#33.62±5.61##26.36±7.14##

4 討論

在本研究中，通過水提醇沉法，提取得到鹽炙車前子多糖，多糖得率為10.90%。采用苯酚-硫酸法、硫酸-咔唑法、考馬斯亮藍法，測得鹽炙車前子多糖中總糖含量為32.27%、糖醛酸含量為30.71%、蛋白質的含量為3.46%。采用PMP衍生化法對多糖進行單糖組成分析，測得鹽炙車前子多糖主要由Glc、Ara和Xyl組成，其摩爾比為Man∶Rha∶Gal∶Glc∶Ara∶Xyl∶Fuc=1.07∶1.49∶5.46∶14.94∶14.34∶42.86∶3.63，是一種阿拉伯木聚糖。

痛風性腎病是由于嘌呤代謝紊亂，體內血UA水平過高，UA結晶沉積于腎臟的腎髓質、間質以及遠端集合管，引發腎實質性病變。目前臨床上治療痛風性腎病的主要藥物也多為降UA或抑制UA生成的藥物，來控制血UA的水平，進而緩解癥狀[21-23]。本研究結果顯示，與模型組比較，陽性藥組、鹽炙多糖中、高劑量組血UA的水平均顯著降低。

多種腎臟損傷疾病可表現為尿蛋白陽性，而尿蛋白本身又能加重腎小球硬化和腎間質纖維化的進程，進一步誘導腎臟損傷。因此常用尿蛋白的水平來判斷腎臟是否有病變[24]。血清中的BUN和CRE是考察腎功能是否正常的重要指標。BUN是人體蛋白代謝的重要產物，腎臟是其主要的排泄器官，當腎功能受損時，BUN的濃度會升高。CRE是肌肉代謝的最終產物，可通過腎小球濾過排出體外，人體每日體內產生的肌酐，一般不受尿量影響可全部隨尿排出。當腎功能衰退時，血清中CRE含量升高。因此，如果BUN和CRE二者同時升高，說明腎臟有嚴重損害[25-26]。本研究結果顯示，模型組大鼠24 h尿蛋白水平，隨造模時間的延長不斷升高，血清中BUN和CRE的水平顯著升高，與空白組比較，均有統計學意義。與模型組比較，陽性藥組、鹽炙車前子多糖中、高劑量組大鼠24 h尿蛋白水平，血BUN和CRE的水平均有所降低，具有統計學意義。綜上所述，結合腎臟組織表觀特征和腎組織病理變化觀察結果表明，陽性藥別嘌醇、鹽炙車前子多糖可以改善腎小球濾過功能，降低痛風性腎病模型大鼠的血UA、BUN和CRE的水平，改善腎功能。提示鹽炙車前子多糖對痛風性腎病大鼠具有預防作用，為鹽炙車前子多糖用于治療痛風性腎病奠定了基礎。