響應(yīng)面法優(yōu)化紫丁香葉總黃酮超聲提取工藝

李菁，杜少兵 ，楊蕾 ，周慧慧 ，孟祎 ，薛志鵬，王小平 ，2，白吉慶 ，2

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中藥原料質(zhì)量監(jiān)測技術(shù)服務(wù)中心，陜西 咸陽 712046）

紫丁香SyringaoblateLindl.是木犀科丁香屬多年生灌木或小喬木[1]，具有清熱解毒、利濕退黃的功效[2]，用于治療急性瀉痢、黃疸型肝炎、火眼、瘡瘍等[3-4]。現(xiàn)代研究表明，紫丁香葉中含有黃酮類、苯丙素類、三萜類、環(huán)烯醚萜類等多種化學(xué)成分[3-8]，其中黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗微生物、抗炎鎮(zhèn)痛、保肝降血脂等多種藥理活性[9-11]。響應(yīng)面法是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，可全面考察各因素之間的交互作用，改善正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中精度與預(yù)測性較差等不足[12]。由于黃酮類成分具有多種生物活性，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)[13]，開發(fā)應(yīng)用前景較廣，而關(guān)于紫丁香葉總黃酮的研究報(bào)道較少，因此，本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化紫丁香葉總黃酮的超聲提取工藝，擬為紫丁香葉總黃酮的高效提取及后續(xù)的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-6100 DOUBLE BEAM紫外-可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；KQ-300VDE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子分析天平（瑞士MettlerToledo公司，精度：0.01 mg，量程：81 g/220 g～0.01 g/0.1 mg）；DHG-9075A干燥箱（上海恒科有限公司）；LG-01高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。

1.2 試劑與藥物

紫丁香葉采自陜西省富縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)白吉慶教授鑒定為木犀科丁香屬紫丁香Syringa oblataLindl.的干燥葉（標(biāo)本存放于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源普查樣本儲藏室，標(biāo)本號：20200412LY）；蘆丁對照品（純度≥92.5%，批號10080-200707，中國藥品生物制品檢定所）；無水乙醇、Al（NO3）3、NaOH、NaNO2（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定方法的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 取蘆丁4.60 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加適量95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的乙醇溶解后定容，即得0.18 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 精密稱定一定量的紫丁香葉粉末（過二號篩），按照料液比（g∶mL）1∶20加入55%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇，按照超聲波功率為90W、頻率為45 kHz超聲50 min，提取2次，合并2次續(xù)濾液并定容，即得。

2.1.3 檢測波長的選擇 精密吸取供試品溶液、對照品溶液各1 mL，置于25 mL量瓶中，加入5%NaNO2溶液1 mL，混勻，放置6 min，再加入10%Al（NO3）31 mL，混勻，放置6 min，再加入4%NaOH溶液10 mL，用相應(yīng)溶劑定容，混勻，放置15 min。以相應(yīng)試劑作為空白，在波長為400～800 nm范圍進(jìn)行測定，結(jié)果顯示上述2種溶液在505 nm處均有最大吸收，故選擇檢測波長為505 nm。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取上述對照品溶液 0、1、2、3、4、5 mL，置于 25 mL 量瓶中，按“2.1.3”項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，在505 nm處測定吸光度。將蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）設(shè)為橫坐標(biāo)、吸光度設(shè)為縱坐標(biāo)，線性回歸，得回歸方程y=10.784x+0.008（r=0.999 5），表明在0.000～0.092 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，在505 nm處測定，連續(xù)測定6次，結(jié)果測得吸光度的RSD值為0.01%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱定樣品粉末，按“2.1.2”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，在505 nm處測定吸光度計(jì)算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（107.43±1.31）mg/g，RSD值為0.75%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，分別于0、1、2、4、6、8、12 h在505 nm處測定吸光度，結(jié)果顯示吸光度的RSD值為2.14%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 取總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)已知的樣品1 g，精密稱定6份，分別加入對照品0.05 g，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)方法進(jìn)行顯色，在505 nm測定吸光度，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果顯示平均加樣回收率為（98.07±1.46）%，其RSD為1.49%，見表1，表明方法的加樣回收率符合要求。

表1 總黃酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The recovery results of total flavonoids

2.2 單因素試驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別考察料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度、提取次數(shù)對紫丁香葉總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響。

2.2.1 料液比 取樣品粉末1 g，精密稱定，按照料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，分別加入體積分?jǐn)?shù)為55%的乙醇溶液，溫度設(shè)定50℃，超聲處理50 min，超聲波功率為90 W、頻率為45 kHz，提取1次，測定吸光度計(jì)算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖1。可見，料液比（g∶mL）為1∶20時(shí)，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多；料液比大于1∶40時(shí)，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)無顯著性差異，為節(jié)約溶劑，故選定料液比（g∶mL）為1∶20。

圖1 不同料液比對總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 1 Effect of different material liquid ratio on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù) 取樣品粉末1 g，精密稱定，按照料液比為1∶20，分別加入25%、35%、45%、55%、65%、75%的乙醇，50℃、超聲波功率為90W、頻率為45 kHz超聲提取50 min，提取1次，測定吸光度計(jì)算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖2。可見，乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%時(shí)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，故選定乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%。

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 2 Effect of different ethanol volume fraction on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.2.3 提取時(shí)間 取樣品粉末1 g，精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)為55%的乙醇20 mL，50℃分別超聲提取10、20、30、40、50、60 min，測定吸光度計(jì)算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖3。可見，提取時(shí)間50 min時(shí)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，故選定提取時(shí)間為50 min。

圖3 不同超聲時(shí)間對總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 3 Effect of different extraction time on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.2.4 超聲溫度 取樣品粉末1 g，精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)為55%的乙醇溶液20 mL，分別于溫度20、30、40、50、60 ℃進(jìn)行超聲提取50 min，測定吸光度計(jì)算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖4。可見，超聲溫度為50℃時(shí)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，故選定超聲溫度為50℃。

圖4 不同超聲溫度對總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 4 Effect of different ultrasonic temperature on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.2.5 提取次數(shù) 取樣品粉末1 g，精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)為55%的乙醇溶液20 mL，50℃分別超聲提取1、2、3次，50 min/次，測定吸光度計(jì)算總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見圖5。可見，提取次數(shù)為2次時(shí)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，故選定提取次數(shù)為2次。

圖5 不同提取次數(shù)對總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Figure 5 Effect of different extraction times on the mass fraction of total flavonoids(n=3)

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過單因素試驗(yàn)，初步確定料液比（g∶mL）為1∶20，乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%，提取時(shí)間50 min，超聲溫度50℃，提取2次較為合適，在單因素試驗(yàn)篩選的基礎(chǔ)上結(jié)合耗能等因素，以料液比（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時(shí)間（C）為影響因素，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評價(jià)指標(biāo)，采用Design-Expert 11軟件，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行3因素3水平17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。因素水平見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面因素水平表Table 2 Coding table of response surface factor level

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Design and results of response surface test

2.3.2 數(shù)學(xué)模型的建立及分析 使用Design Expert軟件進(jìn)行擬合，得到的回歸方程如下：Y=107.15+3.62A-2.81B-2.14C-2.31AB+0.7075AC-0.3625BC-20.30A2-8.92B2-8.15C2，R2=0.9891，與 1 接近，說明通過二次回歸得到的綜合評分模型與試驗(yàn)擬合較好。方差分析結(jié)果見表4。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 The results of variance analysis of regression model

由表4可知，模型極顯著（F=70.82，P＜0.0001），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.1381＞0.05），說明此模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各因素對紫丁香葉總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響由大到小的順序?yàn)锳＞B＞C，即料液比＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間，其中二次項(xiàng)A2、B2、C2的影響極顯著（P＜0.01），可利用此模型來分析和預(yù)測紫丁香葉中的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3.3 響應(yīng)面交互作用分析 用Design Expert 11軟件繪制的各因素交互作用的曲面圖與等高線圖，可直觀地反映各因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響程度，響應(yīng)面圖的坡度越陡表示兩個(gè)因素之間交互作用越大，等高線圖為橢圓時(shí)表示兩因素交互作用顯著[14-17]。由圖6可知，料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)之間的曲線最陡峭、提取時(shí)間次之，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間的等高線圖最圓，說明料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)之間的交互作用對響應(yīng)值（總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的影響最顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間之間的交互作用對響應(yīng)值（總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的影響最不顯著，與表4中 AB（F=4.89，P=0.062 7）＞AC（F=0.457 4，P=0.520 6）＞BC（F=0.120 1，P=0.739 1）相對應(yīng)。

圖6 各因素交互作用的曲面圖與等高線圖Figure 6 Surface and contour plots of the interaction of various factors

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過Design Expert 11軟件計(jì)算得出最優(yōu)提取工藝為：料液比（g∶mL）1∶20.964、乙醇體積分?jǐn)?shù)53.322%、提取時(shí)間48.769 min，預(yù)測總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為107.692 mg/g。考慮到實(shí)際實(shí)驗(yàn)的可操作性，將優(yōu)化條件修正為料液比（g∶mL）1∶20、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、提取時(shí)間50 min，紫丁香葉總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（106.50±1.21）mg/g（n=3），與預(yù)測值107.69 mg/g接近，表明方法穩(wěn)定可行。

3 討論

植物中總黃酮的提取方法有回流提取法、熱浸提法、超聲提取法、微波萃取提取法等[18-19]，超聲波提取可利用超聲波的空化作用增加溶劑穿透能力，有效破壞組織的細(xì)胞壁，促進(jìn)總黃酮釋放到溶劑中從而提高提取率，提取率相對較高且節(jié)能環(huán)保[20-21]。常用的優(yōu)化提取工藝的方法有響應(yīng)面法、正交試驗(yàn)法、均勻設(shè)計(jì)法等，均勻設(shè)計(jì)用于水平數(shù)較多且各因素水平數(shù)不等的情況[14]，響應(yīng)面法是一種綜合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法，可全面考察各因素之間的交互作用，改善正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中精度與預(yù)測性較差等不足[12]。因此本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化紫丁香葉總黃酮超聲提取工藝。

單因素試驗(yàn)中，分別考察了料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、超聲溫度、提取次數(shù)5個(gè)因素對于總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，由于超聲過程中儀器自身發(fā)熱會對超聲溫度產(chǎn)生一定的影響，因此選擇以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間為影響因素，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評價(jià)指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化紫丁香葉總黃酮提取工藝，得到最佳工藝為：料液比為1∶20（g∶mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%、提取時(shí)間50 min，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與預(yù)測值相接近，說明響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取工藝的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為紫丁香葉總黃酮的資源開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。