基于網絡藥理學探究附子理中丸治療潰瘍性結腸炎的機制

孫健淇張若琛張穎利解俊杰石妍

（1.內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院藥學部，內蒙古 包頭014030； 2.包頭市第九中學，內蒙古包頭014000； 3.內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院醫學整形外科，內蒙古 包頭014030； 4.內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院黨政辦公室，內蒙古 包頭014030； 5.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院藥劑科，內蒙古 包頭014010）

潰瘍性結腸炎是一種病因尚不確切的非特異性腸道疾病，臨床表現為腹痛、腹瀉、里急后重及黏液膿血便等，常呈連續慢性炎癥反應狀態，發作與緩解交替，遷延不愈，根治困難，給患者的生理和精神造成極大困擾。臨床治療常采用氨基水楊酸、糖皮質激素和免疫抑制劑等藥物，然而常規治療難以有效緩解病情和防止復發，還可能引起多種不良反應。因此，探究潰瘍性結腸炎的有效治療方法已成為臨床研究的熱點［1］。

附子理中丸由附子、干姜、白術、黨參、甘草組成，原方出自《閻氏小兒方論》，后收錄于《國家基本藥物目錄》，具有溫陽祛寒、益氣健脾之功，多用于脾胃虛寒所致脘腹冷痛、呃逆、腸易激綜合征［2］，對潰瘍性結腸炎的療效顯著［3-4］，作用機制與炎癥密切相關。

網絡藥理學是融合了計算機技術、系統生物學、高通量篩選等技術，研究“藥物-靶點-疾病”之間復雜關系的交叉學科，通過對中藥多成分、多靶點、多通路、多功能以及中藥配伍進行梳理，適合于中藥方劑作用機制的研究［5］，已有較多學者通過網絡藥理學方法預測到中藥的治療靶點［6-7］。本研究采用網絡藥理學全面解析附子理中丸治療潰瘍性結腸炎的作用機制，以期為潰瘍性結腸炎治療研究提供新的方法與思路。

1 材料與方法

1.1 動物實驗

1.1.1 動物及分組 SD 大鼠，清潔級，雄性，體質量220～280 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養于明暗交替的清潔級動物飼養室中，環境溫度24～26 ℃，相對濕度50%。動物實驗遵循包頭醫學院動物倫理委員會規定。將60 只雄性大鼠編號，按隨機數字表法分為對照組、模型組和附子理中丸組，每組20 只。

1.1.2 造模及給藥 參考文獻［8］報道方法，DSS 自由飲用法造模。適應性飼喂養7 d 后將大鼠納入實驗，對照組大鼠給予普通飼料喂養，模型組和附子理中丸組大鼠自由飲用5.0% DSS 水溶液，連續7 d，大鼠出現腹瀉、膿血便等癥狀，表明大鼠造模成功。附子理中丸（批號Z15021454）購自包頭中藥有限責任公司，研磨后制成0.75 g／mL 混懸液，造模成功后，附子理中丸組給予附子理中丸水溶液灌胃；對照組和模型組給予等量生理鹽水，給藥量為15 g／kg，每天1次，連續2 周。

1.1.3 一般行為及DAI 評分 造模開始后，在1、3、7、14、21 d 對各組大鼠進行DAI 評分，計算公式為DAI ＝（體質量下降率分數＋大便性狀分數＋便血情況分數）／3，評分標準見表1。

表1 DAI 評分標準

1.1.4 標本采集 各組大鼠于末次藥物干預后，禁食不禁水24 h，稱定體質量，10%水合氯酸（3.5 mL／kg）腹腔注射麻醉，剖開腹腔，自肛門向上截取長度約8 cm 結腸，縱向剪開后用生理鹽水沖洗清潔，剪碎后置于無酶凍存管于液氮中保存待測。取材完畢后處死大鼠。

1.1.5 結腸組織病理學檢查 取大鼠結腸標本置于組織固定液中固定，制作蠟塊、脫水、HE 染色，顯微鏡下進行病理學檢查。

1.2 網絡藥理學分析

1.2.1 附子理中丸的活性成分及作用靶點 應用TCMSP 2.3 數據庫［9］（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）獲得附子理中丸中附子、黨參、炒白術、甘草、干姜的活性化合物信息，活性化合物篩選條件設為經口服生物利用度（OB）≥30 %，類藥性（DL）≥0.18。預測活性化合物作用靶點采用Swisstarget prediction 數據庫（http：／ ／www.swisstargetprediction.ch），導入活性化合物SMILES ID 進行預測，保存預測靶點信息。

1.2.2 潰瘍性結腸炎靶點 應用DISGENET 5.0 數據庫［10］（http：／ ／www.disgenet.org／），以“Ulcerative colitis”為關鍵詞，找到潰瘍性結腸炎疾病相關靶點，刪除重復靶點及靶點-疾病相關性得分小于0.01 的靶點，與“1.2.1”方法中所獲得的附子理中丸預測靶點相匹配，得到附子理中丸治療潰瘍性結腸炎的作用靶點。

1.2.3 VENNY 圖的制作 使用DrawVennDiagram 網站（http：／ ／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）將5 味單味藥及其潰瘍性結腸炎相關靶點導入，應用Venn diagram網站（http：／ ／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）制作VENNY圖，找到多個單味藥共同作用的靶點。

1.2.4 GO 分析及KEGG 分析 應用Cytoscape 2.3.5 軟件中Clue GO 插件將附子理中丸治療潰瘍性結腸炎靶點uniprot ID 導入，設置物種，選擇“GO 生物過程分析及KEGG 通路分析”，設置P值＜0.05，提交獲得相關結果。GO 生物過程分析結果應用氣泡圖展示，KEGG 通路分析結果應用Cytoscape 進行可視化處理。

1.2.5 關鍵節點選擇 應用Cytoscape 軟件對KEGG 分析結果構建網絡，利用cytoHubba 插件對靶點進行排序，cytoHubba 應用的是Maximal Clique Centrality 方法，其綜合11 個拓撲分析方法和6 個中心性方法，可綜合多種因素選擇關鍵靶點。

1.2.6 分子對接驗證 選擇關鍵靶點蛋白及其作用活性化合物，將下載的活性化合物結構式導入薛定諤Maestro中，優化所有小分子結構，預測其質子化狀態，生成立體異構體。在PROTEIN DATA BANK 數據庫（https：／ ／www.rcsb.org）中下載蛋白結構式，將靶點蛋白導入軟件中，對其進行加氫原子、去水分子和雜原子集團等處理，簡單優化蛋白。對蛋白進行定義對接區域，生成格點文件，把處理好的小分子與定義的格點文件進行對接。

1.3 靶點驗證 Western blot 檢測NF-κB1（p50）、NF-κB3（p65）、TNF-α、IL-6、MAPK1 蛋白表達。使用RIPA 裂解液從結腸組織中提取總蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，計算蛋白上樣量，進行電泳，轉膜，封閉，一抗NF-κB1、TNF-α、IL-6（美國Proteintech 公司）和NF-κB3、MAPK1（英國Abcam 公司）孵育，洗膜，二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）孵育，洗膜，曝光掃描，并利用Image J軟件進行數據分析。

1.4 統計學分析 采用SPSS 21.0 軟件處理，計量數據以（）表示，組間均數比較采用單因素方差分析，方差齊采用SNK-q檢驗，方差不齊采用Game-Howell 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物實驗DAI 評分及大鼠結腸組織病理形態觀察如表2 所示，自開始造模為1 d 起算，模型組和附子理中丸組在7 d 評分最高，表示造模成功。用藥2 周后，與模型組比較，附子理中丸組大鼠癥狀好轉（P＜0.01）。如圖1所示，對照組大鼠結腸組織結構完整，未見潰瘍形成；模型組大鼠發現的結構破壞，潰瘍形成，組織大量炎性細胞浸潤；附子理中丸組發現潰瘍愈合，炎性細胞浸潤減少。

表2 各組大鼠不同時間點DAI 評分（， n＝20）

表2 各組大鼠不同時間點DAI 評分（， n＝20）

注：與模型組比較，＃＃P＜0.01。

圖1 各組大鼠結腸組織形態（HE 染色，×50）

2.2 網絡藥理學預測

2.2.1 靶點預測 為尋找附子理中丸的成分，應用TCMSP數據庫檢索到相關活性化合物信息，并下載其分子結構式。在Swisstarget 數據庫中基于分子結構預測附子理中丸的潛在靶點，并將靶點與潰瘍性結腸炎的靶點進行對比，重復部分為預測的治療靶點，整理靶點信息，得到潛在靶點76個，見表3。

表3 附子理中丸治療潰瘍性結腸炎的潛在靶點

續表3

2.2.2 VENNY圖如圖2 所示，預測結果中多數靶點可與多種藥物作用，其中脂肪酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，FAAH）、一氧化氮合酶2（nitric oxide synthase 2，NOS2）、維生素D 受體（vitamin D receptor，VDR）、過氧化物酶體增殖物激活受體α／β（peroxisome proliferator activated receptorα／β，PPARA）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）等與潰瘍性結腸炎密切相關的靶點可與5 味藥共同作用。

圖2 藥物-潛在靶點韋恩圖

2.2.3 靶點分析 GO 富集生物過程分析結果如圖3 所示，靶點主要參與調節白細胞介導的細胞毒性、血管生成的正調控、樹突細胞趨化性、對銨離子的反應、調控自噬等多種生物過程，氣泡圖中Y 軸代表生物過程名稱，X 軸代表靶點在生物過程中的比例，氣泡顏色代表P值，節點大小代表參與生物過程的靶點數；KEGG 通路分析結果如圖4 所示，靶點涉及Toll 樣受體（toll like receptors，TLR）信號通路、NOD 樣受體（nucleotide binding oligomerization domain like receptors，NLR）信號通路、Janus 激酶／信號轉導與轉錄激活子（the Janus kinase／signal transducer and activator of tran-ions，JAK／STAT）信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、白介素-17（interleukin -17，IL-17）信號通路、Th1 和Th2 細胞分化、Th17 細胞分化、T 細胞受體信號通路、TNF-α 信號通路等，均與潰瘍性結腸炎密切相關，圖中藍色節點為靶點，紅色節點為通路，共80 個節點，438條邊。

圖3 附子理中丸靶點參與的生物過程

圖4 靶點-通路圖

2.2.4 關鍵節點選擇及分子對接 基于靶點通路圖，應用Cytoscape 軟件的cytoHubba 插件對靶點進行分析，確定關鍵靶點為MAPK1、NF-κB1、TNF-α、IL-6、NF-κB3，其自由度和臨近靶點數量等參數均優于其他靶點。找到作用于關鍵靶點的活性化合物成分，應用Maestro 進行分子對接，對接結果中“吉布斯自由能絕對值＞5”為有效對接。結果如圖5 所示，其中5 個關鍵靶點可與不同成分作用，證明其作為潰瘍性結腸炎潛在靶點的可行性。

圖5 分子對接結果圖

2.3 關鍵靶點的驗證 如圖6 所示，與模型組比較，附子理中丸能夠降低NF-κB1 p50、TNF-α、IL-6、NF-κB3 p65 的蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01），而對MAPK1 蛋白表達無影響（P＞0.05），表明附子理中丸能夠通過NF-κB1 p50、TNF-α、IL-6 及NF-κB3 p65 靶點發揮保護作用。

圖6 附子理中丸對潛在靶點蛋白表達的影響

3 討論

附子理中丸具有溫陽祛寒、益氣健脾之功，多用于脾胃虛寒所致脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、手足不溫等癥，臨床使用廣泛。胡利群等［11］應用附子理中丸聯合五維他口服溶液治療潰瘍性結腸炎，可改善疾病癥狀。附子理中丸療效確切，作用迅速，但對其治療潰瘍性結腸炎的基礎研究尚不多見。

采用DSS 制備大鼠潰瘍性結腸炎模型，發現給予附子理中丸能夠緩解癥狀，促進潰瘍愈合，減少組織炎性細胞浸潤。網絡藥理學分析發現，附子理中丸主要通過參與上皮細胞凋亡過程、調控自噬、平滑肌收縮的積極調節、急性炎癥反應的調節等生物過程來干預疾病的發生發展，反映出復方多途徑的特點；參與調控的通路有NF-κB 信號通路、TNF-α 信號通路、T 細胞受體信號通路、Toll 樣受體信號通路、Th1 和Th2 細胞分化、Th17 細胞分化等，且均與炎癥密切相關，由此推測附子理中丸可能主要通過調控各種信號因子發揮抗炎作用。結合多種分析結果，最終篩選到附子理中丸治療潰瘍性結腸炎的關鍵靶點為MAPK1、NF-κB1、TNF-α、IL-6、NF-κB3。

小腸上皮細胞中IL-8 的產生依賴ERK1／2 通路［12］，而IL-8 在結腸免疫系統中發揮潛在作用［13］，但本實驗結果發現，附子理中丸不能對該靶點蛋白表達發揮作用，表明MAPK1 可能不是其治療靶點。關鍵靶點中TNF-α、IL-6 作為重要的炎癥介質，其表達升高會導致細胞因子失衡，參與疾病的發生發展。在柳氮磺吡啶聯合雙歧桿菌三聯活菌膠囊治療潰瘍性結腸炎的研究中發現，藥物可通過降低炎癥因子的表達恢復機體自身免疫，從而糾正潰瘍性結腸炎病理過程中出現的細胞因子紊亂［14］。本實驗研究發現，潰瘍性結腸炎中存在TNF-α、IL-6 的高表達，表明其作為治療靶點的可行性。

NF-κB 是一種重要的調節因子包括NF-κB1 p50、NFκB2 p52、RE-LA p65、RELB 和c-REL 等5 個成員，它們以同型和異型二聚體的各種組合形式存在［15］。在大多數細胞中，NF-κB 存在的主要形式是由RE-LA 和NF-κB1 組成的異二聚體［16］，其中，NF-κB1 負責與DNA 結合，RE-LA 參與調控下游多種靶基因的轉錄活性［17］。Hegazy等［18］研究表明，潰瘍性結腸炎患者的腸黏膜TNF-α 和RE-LA ／p65 高表達，通過降低IL-6、TNF-α 和p65 表達，可以減輕炎癥反應，改善黏膜狀態。國外學者通過抑制NF-κB 亞基（p65 ／p50）的激活和轉運，抑制了潰瘍性結腸炎患者腸黏膜的炎性改變，起到保護腸黏膜的作用［19］，這提示附子理中丸可通過該途徑起到保護和修復黏膜的作用。本實驗驗證發現，附子理中丸可降低NF-κB1、TNF-α、IL-6、NF-κB3 蛋白表達，對潰瘍性結腸炎起到保護作用。

綜上所述，附子理中丸可通過多途徑、多靶點來治療潰瘍性結腸炎，在靶點間同樣存在協同作用。本研究全面分析了附子理中丸治療潰瘍性結腸炎的機制，為臨床指導用藥提供了新的理論依據，也為今后繼續探索中藥附子理中丸的作用機制提供了新線索。