鞍葉羊蹄甲對三叉神經痛模型大鼠的鎮痛作用

陳亞男劉漢福肖朝江姜北沈磊

（1.大理大學藥物研究所，云南 大理671000； 2.大理大學藥學院，云南 大理671000）

神經病理性疼痛屬于慢性疼痛的一種，其全球發病率約為5%［1］，神經病理性疼痛患者多伴有睡眠障礙、焦慮、抑郁等癥狀，從而導致生活質量嚴重下降［2］。目前治療神經病理性疼痛的藥物臨床療效不明確，副作用較多，且缺乏針對性，因此有必要尋找有效治療神經病理性疼痛，且副作用小的藥物。治療神經病理性疼痛的中藥不良反應低且多為抗炎鎮痛類藥物。鞍葉羊蹄甲Bauhinia brachycarpaBenth 屬于豆科羊蹄甲屬植物，分布于四川、云南、甘肅、湖北等地，其民間用藥大都與炎癥有關，如彝族用藥記載其根、葉治療風濕疼痛，跌打損傷；白族用藥記載其根用于安神、止痛、散結、筋骨疼痛［3］。本課題組前期對鞍葉羊蹄甲的抗炎鎮痛活性進行了研究，發現鞍葉羊蹄甲總提物可抑制醋酸誘導的外周炎性疼痛，并減少熱板引起的中樞性疼痛［4］。因此本實驗擬建立三叉神經痛模型，探討鞍葉羊蹄甲對大鼠的鎮痛作用和可能機制，為開發鞍葉羊蹄甲的藥用價值提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠，SPF級，雄性，體質量180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCKY（湘）2019-0004。動物實驗完全依照大理大學醫學倫理委員會及大理大學藥學與化學學院實驗動物管理委員會的相關規定進行。

1.2 試劑與藥物 鞍葉羊蹄甲于2019 年8 月采自云南大理漾濞縣，由大理大學藥學院張德全教授鑒定為豆科羊蹄甲屬植物鞍葉羊蹄甲Bauhinia brachycarpaBenth?？R西平（江蘇鵬鷂藥業有限公司，批號2005241）。TNF-α、PGE2、SP ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號20201128、20201128、2020122）。水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號Q／12HB 4218-2017）。

1.3 儀器 4-0 鉻制羊腸線（上海浦東金環醫療用品股份有限公司）；RE-5205 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；Von Frey 疼痛測試棒（美國DanMic Global 公司）；Varioskan LUX 功能酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）；BX53 型生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；0408-2 型臺式低速離心機［上海醫療器械（集團）有限公司］。

2 方法

2.1 鞍葉羊蹄甲提取物制備 取鞍葉羊蹄甲干燥地上部分19.5 kg，粉碎后用95%乙醇冷浸提取5次，每次24 h，過濾后合并濾液，用旋轉蒸發儀減壓回收乙醇后得總浸膏1 878.5 g，用水分散、溶解，經過凍干，最后得到凍干粉1 519.5 g。使用時用0.5% CMC-Na 溶液將凍干粉稀釋至相應劑量。實驗用劑量根據預實驗結果確定。

2.2 動物分組、造模及給藥 實驗前適應性訓練大鼠，用Von Frey 疼痛測試棒連續刺激大鼠兩側須墊部3次，每次間隔時間30 s，直至大鼠對刺激反應轉為平靜狀態，連續3 d。選取3 d 痛閾值均大于15 g 的大鼠共48只，隨機分為假手術組和手術組。手術組大鼠建立三叉神經痛模型［5］，具體為腹腔注射10%水合氯醛（4 mL／kg）麻醉大鼠，仰臥位固定后，于口腔內左側軟腭第1 個皺褶水平，做1 個長約1 cm 切口暴露眶下神經，依次用2 根4-0 鉻制羊腸線結扎眶下神經（2 根線相距約2 mm），結扎松緊度要求僅改變神經直徑而不影響神經血液循環，縫合傷口完成模型；假手術組只暴露眶下神經不結扎。將造模成功的大鼠隨機分為5組，分別為模型組、卡馬西平組（陽性對照，150 mg／kg）和鞍葉羊蹄甲高、中、低劑量組（500、250、125 mg／kg）。手術第14 天開始灌胃給予相應藥物，假手術組、模型組灌胃給予0.5% CMC-Na，給藥容量均為1.5 mL／kg，每天給藥1次，連續14 d，整個實驗周期共28 d。

2.3 指標檢測

2.3.1 機械痛閾值 各組大鼠均于手術前、手術當天、手術后測定痛閾值。在疼痛行為學測試前，將大鼠放置于網狀金屬籠子里，適應周圍環境10 min。用Von Frey 疼痛測試棒對大鼠的手術同側須墊部進行刺激，刺激從0.008 g開始逐漸增加，3 次／側，每次刺激連續2下，每次刺激至少間隔30 s，直到出現陽性反應，記錄所采用的刺激強度。大鼠在最大刺激強度26 g 時仍未出現陽性反應，則將痛閾值記為26 g，上述刺激連續測定3次，每次間隔10 min，取3 次測定的平均值為大鼠三叉神經痛閾值。大鼠陽性反應包括退縮反應，表現為刺激時頭部退縮，有時伴有刺激同側面部的洗臉行為；逃跑或攻擊行為，表現為避免繼續接觸刺激物，身體移動遠離刺激物或主動咬抓刺激物；非對稱性的洗臉，表現為對側面部至少大于3 次的不間斷性洗臉行為。

2.3.2 血清中TNF-α、PGE2、SP 水平 末次給藥后禁食24 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血，室溫放置20 min，2 000 r／min 離心20 min 取血清。ELISA 試劑盒檢測血清TNF-α、PGE2和SP 水平。

2.3.3 眶下神經組織病理學觀察 取血后暴露心臟，注射生理鹽水進行心臟灌流，直至右心耳流出清亮生理鹽水，再從心臟注入4%多聚甲醛固定組織，然后暴露眶下神經，切取包含縮窄環在內約長0.5 cm 的眶下神經組織，放入4%多聚甲醛中固定。常規脫水、包埋、進行HE 染色，觀察組織病理學變化。根據施萬細胞的數量對眶下神經組織病理變化進行分析，每張病理切片選擇施萬細胞數量較多的6 條神經纖維，計數每條纖維中3 cm×3 cm 正方形區域內的施萬細胞核數量，統計6 條纖維總的細胞核數目記為該切片所含細胞數。

2.4 統計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），組間差異采用LSD 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 鞍葉羊蹄甲對三叉神經痛大鼠機械痛閾值的影響 如表1 所示，與假手術組比較，模型組大鼠的機械痛閾值先升高，并于術后第8 天開始下降，術后第14 天手術各組大鼠的機械痛閾值下降至最低值（P＜0.01）。術后第14 天開始給藥，給藥14 d后，與模型組比較，卡馬西平和鞍葉羊蹄甲高劑量組均能增加三叉神經痛大鼠的機械痛閾值（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 鞍葉羊蹄甲對三叉神經痛大鼠機械痛閾值的影響（， n＝8）

表1 鞍葉羊蹄甲對三叉神經痛大鼠機械痛閾值的影響（， n＝8）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 鞍葉羊蹄甲對三叉神經痛大鼠血清中TNF-α、PGE2、SP 水平的影響 如表2 所示，與假手術組比較，模型組大鼠血清中TNF-α、PGE2、SP 水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，卡馬西平和鞍葉羊蹄甲高、中劑量均能降低血清中TNF-α、PGE2水平（P＜0.05，P＜0.01），鞍葉羊蹄甲中劑量降低血清中SP 水平（P＜0.01）。

表2 鞍葉羊蹄甲對三叉神經痛大鼠血清中TNF-α、PGE2、SP 水平的影響（， n＝8）

表2 鞍葉羊蹄甲對三叉神經痛大鼠血清中TNF-α、PGE2、SP 水平的影響（， n＝8）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 鞍葉羊蹄甲對三叉神經痛大鼠眶下神經組織病理學改變的影響 如圖1 所示，假手術組大鼠眶下神經纖維分布均勻，施萬細胞核呈紫色，未見病理變化；模型組大鼠眶下，神經纖維排列紊亂，施萬細胞增生，神經變性；各劑量鞍葉羊蹄甲與卡馬西平均能不同程度的改善神經纖維變性，減輕炎癥反應。如表3 所示，與假手術組比較，模型組大鼠眶下神經組織中施萬細胞數量增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組施萬細胞數量均減少（P＜0.01），說明鞍葉羊蹄甲可抑制施萬細胞增生。

圖1 鞍葉羊蹄甲對三叉神經痛大鼠眶下神經病理組織學的影響（×400）

表3 鞍葉羊蹄甲對三叉神經痛大鼠眶下神經組織施萬細胞數目的影響（， n＝8）

表3 鞍葉羊蹄甲對三叉神經痛大鼠眶下神經組織施萬細胞數目的影響（， n＝8）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

4 討論

神經病理性疼痛為神經系統損傷或功能障礙引起的疼痛，其發生機制分為中樞敏化、外周敏化以及中樞下行抑制性調控改變。對于神經病理性疼痛的治療是非特異性的，目前治療的一線藥物有抗驚厥藥［6］、三環類抗抑郁藥、選擇性NA 和5-HT 再攝取抑制藥，但是這些藥物普遍具有療效不明確，缺乏針對性或長期使用伴有嚴重副作用和成癮性等問題。

治療神經病理性疼痛的中藥不良反應低，且大多為抗炎鎮痛類藥物。本實驗數據表明鞍葉羊蹄甲可提高三叉神經痛大鼠的機械痛閾值，其機制可能與抑制神經病理性疼痛中產生的過多炎癥因子有關。有研究表明，人類神經組織中炎癥細胞聚集和炎癥因子過度表達的嚴重程度與神經病理性疼痛的程度有關。大量炎癥介質的釋放不僅會誘導和維持中樞敏化，還會進一步的促進外周敏化［7］。TNF-α廣泛存在于包括神經組織在內的各種組織中，在神經病理性疼痛模型中，TNF-α 在激活其他信號通路方面起著主導作用［8］。SP 是一種興奮性神經遞質，屬速激肽族，由感覺神經元產生，當傷害性刺激激活感覺神經元時，SP 會在外周神經組織以及脊髓中釋放，會促進痛覺過敏的產生，從而介導疼痛信號傳遞［9-11］。PGE2對周圍組織和脊髓中的疼痛信號有很大的影響，并且參與了神經病理性疼痛的誘導與維持［12］。本實驗結果顯示，鞍葉羊蹄甲高、中劑量均能降低三叉神經痛模型大鼠血清中TNF-α、PGE2、SP 水平，尤其是中劑量效果最好，并優于陽性藥卡馬西平，表明鞍葉羊蹄甲可通過抑制過度表達的炎癥因子，對三叉神經痛大鼠產生鎮痛作用。

施萬細胞是周圍神經系統中的神經膠質細胞。激活的施萬細胞和巨噬細胞被認為是神經損傷早期產生TNF 的關鍵。施萬細胞的TRPA1 激活后誘導并維持巨噬細胞對受損神經的浸潤，從而維持機械痛覺的超敏狀態［13］。在神經損傷的條件下，激活的施萬細胞能產生生長因子、細胞因子和趨化因子等大分子，又能產生活性小分子（如ATP），這些炎癥因子在神經病理性疼痛中均起到了關鍵作用［14］。本實驗結果顯示，鞍葉羊蹄甲能降低眶下神經組織中的施萬細胞數量，表明鞍葉羊蹄甲可抑制施萬細胞增生來降低神經病理性疼痛中產生的炎癥因子。

綜上所述，鞍葉羊蹄甲對于神經病理性疼痛具有鎮痛作用，其機制可能與抑制炎癥因子的產生有關。下一步本課題組將針對相關的炎癥級聯反應，繼續探討鞍葉羊蹄甲對神經病理性疼痛的鎮痛作用機制。