疏風解毒膠囊對干酵母致大鼠發(fā)熱模型的解熱作用

儲小毛李澤庚 高雅婷 王新汝劉蘭婷尤巧云張裕童佳兵

（1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥230012； 2.安徽省中醫(yī)藥科學院中醫(yī)呼吸病防治研究所，安徽合肥230012； 3.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥230012）

發(fā)熱是臨床上常見的癥狀之一，可見于普通感冒、流行性感冒、肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病，是機體的保護性反應，與機體的反應性密切相關(guān)［1］。發(fā)熱是由于外源性致熱源等因素刺激機體產(chǎn)生和釋放內(nèi)生致熱源，直接作用于體溫調(diào)控中心下丘腦，調(diào)控中樞介質(zhì)使體溫調(diào)定點上移，升高體溫［2］。疏風解毒膠囊是由湘西土家族名老中醫(yī)楚賢祖?zhèn)鞣絼办疃旧ⅰ卑l(fā)展而成的中成藥，功能疏風清熱、解毒利咽，由虎杖、連翹、板藍根、敗醬草、馬鞭草、柴胡、蘆根、甘草組成，以上8 味藥均具有清熱解毒之功，且該復方制劑臨床常用于急性上呼吸道感染證見風熱犯肺型的治療，退熱效果好、安全性高［3］。劉靜等［4］在酵母致熱模型大鼠的實驗中證實疏風解毒膠囊可通過調(diào)節(jié)PGE2、IL-1、IL-6 等細胞因子水平，發(fā)揮解熱作用，但其解熱機制仍需要進一步驗證。本實驗旨在探討疏風解毒膠囊解熱作用機制，以期為其臨床應用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 大鼠60只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，均由杭州醫(yī)學院提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（皖）2019-0002，動物飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2 試劑與藥物 疏風解毒膠囊（批號Z20090047），購自安徽濟人藥業(yè)股份有限公司；布洛芬片（批號200509063），購自天方藥業(yè)有限公司。大鼠白細胞介素1β（IL-1β）、大鼠白細胞介素6（IL-6）、巨噬細胞炎性蛋白1α（MIP-1α）、前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（貨 號 JYM0419Ra、JYM0646Ra、JYM0670Ra、JYM0446Ra、JYM0635Ra），均購自武漢基因美生物科技有限公司；一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）測定試劑盒（批 號 20210525、20210513），均購自南京建成生物工程研究所；RIPA 細胞裂解液（強）（批號09271919023），購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TLR4、IkBα、COX2抗體（批 號AG05125500、AG02243250、AI12036357），均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；NF-κB p65抗體（批 號GR3236344-1），均購自英國Abcam 公司。安琪高活性干酵母，購自安琪酵母股份有限公司。

1.3 儀器 RT-6000 酶標儀，購自深圳雷杜生命科學股份有限公司；UV-1800 紫外可見分光光度計，購自上海菁華科技儀器有限公司；JW3021HR 離心機，購自安徽嘉文儀器裝備有限公司；GL-88B 漩渦混合器，購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫箱，購自上海三發(fā)科學儀器有限公司。

2 方法

2.1 分組及給藥 適應性喂養(yǎng)大鼠3 d，每天用電子數(shù)字體溫計測量2 次大鼠肛溫，使大鼠適應肛溫測量操作；選擇體溫在36～38.4 ℃，且變化不超過0.4 ℃的大鼠供實驗用。大鼠隨機分為正常組、模型組、布洛芬組（72 mg／kg）及疏風解毒膠囊低、中、高劑量組（1.12、2.25、4.49 g／kg），每組10 只。采取預防給藥方式，第4 天各給藥組按10 mL／kg灌胃給藥，正常組、模型組同法給予等容量生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥3 d。實驗當天禁食不禁水6 h后測量肛溫3次，取均值為基礎體溫。灌胃給藥0.5 h 后開始造模，模型組和各給藥組大鼠皮下注射10 mL／kg 20%干酵母混懸液（由生理鹽水配制），正常組皮下注射等容量生理鹽水。每間隔1 h 測量肛溫1次，記錄數(shù)據(jù)，并于造模5 h 后再次灌胃給藥，造模8 h 后測量肛溫后采集標本。

2.2 標本采集 最后1 次測量肛溫后，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（0.1 mL／kg）進行麻醉，腹主動脈取血，37 ℃靜置1 h，3 500 r／min 離心10 min 得血清。隨后迅速取出全腦，冰浴下取大鼠下丘腦，分別于-80 ℃冰箱及10%甲醛固定液中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 ELISA 檢測血清及下丘腦中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平 取“2.2”項下血清及-80 ℃保存的下丘腦組織，依次按標準品稀釋、加樣、溫浴洗滌、顯色終止的步驟進行操作，以標準品孔為實驗參照，使用酶標儀在450 nm波長處檢測各樣品孔的吸光度值，計算IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平。

2.4 Western blot 檢測下丘腦中TLR4、NF-κB p65、IκBα、COX2 蛋白表達 取“2.2”項下-80 ℃保存的下丘腦組織樣本，裂解后于12 000 r／min 條件下離心并收集上清，提取總蛋白，隨后進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，使用ECL 發(fā)光試劑盒進行顯影，通過分析條帶灰度值計算TLR4、NF-κB p65、IκBα、COX2 蛋白相對表達。

2.5 HE 染色觀察下丘腦組織病理形態(tài) 取“2.2”項下10%甲醛固定液中保存的下丘腦組織樣本，常規(guī)石蠟包埋切片，經(jīng)脫蠟、蘇木素染細胞核、伊紅染細胞質(zhì)、脫水封片后在光學顯微鏡下觀察。

2.6 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 23.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 疏風解毒膠囊對干酵母致發(fā)熱大鼠體溫的影響 如表1 所示，與正常組比較，模型組大鼠造模后6、7、8 h 體溫升高（P＜0.01），表明造模成功；與模型組比較，布洛芬組大鼠造模后6、7、8 h 體溫均降低（P＜0.01），疏風解毒膠囊低劑量組大鼠造模后7、8 h 體溫有降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），疏風解毒膠囊中、高劑量組大鼠造模后7、8 h 體溫均降低，（P＜0.01）。結(jié)果表明，疏風解毒膠囊具有一定的解熱作用。

表1 疏風解毒膠囊對發(fā)熱大鼠體溫的影響（， n＝10）

表1 疏風解毒膠囊對發(fā)熱大鼠體溫的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 疏風解毒膠囊對干酵母致發(fā)熱大鼠下丘腦組織病理變化的影響 正常組大鼠下丘腦神經(jīng)元呈圓形，胞漿染色均勻，細胞核呈圓形，位于細胞中央，神經(jīng)膠質(zhì)細胞較神經(jīng)元體積小，核染色質(zhì)較深，少量神經(jīng)元胞漿出現(xiàn)空泡；模型組大鼠下丘腦神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮，胞質(zhì)呈深伊紅色，部分神經(jīng)元胞漿出現(xiàn)空泡、水腫，細胞外間隙增大，可見炎性細胞浸潤及小膠質(zhì)細胞聚集；與模型組比較，布洛芬組和疏風解毒膠囊各劑量組大鼠下丘腦神經(jīng)元空泡變性、核固縮程度淺，可見少量的炎性細胞浸潤，見圖1。

圖1 各組大鼠下丘腦組織病理變化（HE，×200）

3.3 疏風解毒膠囊對干酵母致發(fā)熱大鼠血清及下丘腦IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清和下丘腦中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，布洛芬組和疏風解毒膠囊各劑量組大鼠血清和下丘腦中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平均降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，疏風解毒膠囊能抑制致熱性細胞因子IL-1β、IL-6 及TNF-α 的生成，進而抑制炎癥因子PGE2的生成，見表2。

表2 疏風解毒膠囊對發(fā)熱大鼠血清及下丘腦IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2 水平的影響（， n＝6）

表2 疏風解毒膠囊對發(fā)熱大鼠血清及下丘腦IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2 水平的影響（， n＝6）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.4 疏風解毒膠囊對干酵母致發(fā)熱大鼠血清MIP-1α 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中MIP-1α 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，布洛芬組和疏風解毒膠囊各劑量組大鼠血清中MIP-1α 水平均降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，疏風解毒膠囊能抑制大鼠血清中MIP-1α 水平，且呈劑量依賴性，見圖2。

圖2 各組大鼠血清MIP-1α 水平（， n＝6）

3.5 疏風解毒膠囊對干酵母致發(fā)熱大鼠下丘腦NOS、NO水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠下丘腦中NOS、NO 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，布洛芬組和疏風解毒膠囊中、高劑量組大鼠下丘腦中NOS、NO 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），疏風解毒膠囊低劑量組大鼠下丘腦中NOS、NO 水平也有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果表明，疏風解毒膠囊能抑制干酵母致發(fā)熱大鼠下丘腦NOS、NO 水平，且呈劑量依賴性，見表3。

表3 疏風解毒膠囊對發(fā)熱大鼠下丘腦NOS、NO 水平的影響（， n＝6）

表3 疏風解毒膠囊對發(fā)熱大鼠下丘腦NOS、NO 水平的影響（， n＝6）

注：與正常組比較，＃＃ P＜0.01；與模型組比較，* P＜0.05，**P＜0.01。

3.6 疏風解毒膠囊對干酵母致發(fā)熱大鼠下丘腦TLR4、NFκB p65、IκBα、COX2 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠下丘腦中TLR4、NF-κB p65、IκBα、COX2 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，布洛芬組和疏風解毒各劑量組大鼠下丘腦中TLR4、NF-κB p65、IκBα、COX2 蛋白表達均降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，疏風解毒膠囊能抑制干酵母致發(fā)熱大鼠下丘腦中TLR4、NF-κB p65、IκBα 及COX2 蛋白表達，且呈劑量依賴性，見表4、圖3。

圖3 各組大鼠下丘腦TLR4、NF-κB p65、IκBα、COX2 蛋白表達

表4 疏風解毒膠囊對發(fā)熱大鼠下丘腦TLR4、NF-κB p65、IκBα、COX2 蛋白表達的影響（， n＝3）

表4 疏風解毒膠囊對發(fā)熱大鼠下丘腦TLR4、NF-κB p65、IκBα、COX2 蛋白表達的影響（， n＝3）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

發(fā)熱可見于諸多疾病，是臨床常見癥狀之一。目前制備動物發(fā)熱模型的方法有很多種，如大鼠皮下注射脂多糖膠原水凝膠、2，4-二硝基苯酚誘導大鼠發(fā)熱，大鼠皮下注射干酵母混懸液，大鼠細菌滴鼻，家兔耳緣靜脈注射速尿，大鼠飲食失節(jié)，大鼠游泳實驗聯(lián)合腹腔注射脂多糖等［5-9］。有研究表明，皮下注射干酵母致大鼠發(fā)熱模型中，大鼠的體溫表現(xiàn)為先下降后上升，于造模后7 h 達到高溫平臺期后持續(xù)相當長時間，這與中醫(yī)學上的衛(wèi)表證及氣分熱證病理機制相符合，且全身炎癥反應及臨床表現(xiàn)與里熱癥類似，因此酵母致大鼠發(fā)熱模型常用于考察清熱類中藥的解熱作用［10-11］。

發(fā)熱由發(fā)熱激活物（本文中為酵母）作用于血液中白細胞（中性粒細胞、嗜酸性粒細胞及單核巨噬細胞）、內(nèi)皮細胞及腫瘤細胞等釋放內(nèi)生致熱原，后者進一步作用于體溫調(diào)節(jié)中樞下丘腦，引起發(fā)熱中樞介質(zhì)的釋放，使體溫失衡［2］。目前已經(jīng)證實IL-1β、TNF-α、IL-6 是重要的內(nèi)生致熱原，可直接或間接引起發(fā)熱中樞介質(zhì)PGE2的釋放，升高體溫［12-13］。發(fā)熱過程涉及的主要通路有EP3 信號轉(zhuǎn)導通路、Toll 樣信號通路及特征性感染反應信號通路，PGE2的釋放增加是上述通路發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中Toll 樣信號通路是通過內(nèi)源性致熱原刺激引起TLR4 受體活化，使TLR4影響巨噬細胞和其他免疫細胞的變化導致核因子κB（NFκB）表達升高，進而使COX2 的合成增加，使PGE2釋放增多，導致發(fā)熱［14-15］。

MIP-1α 是趨化因子亞家族成員之一，通過與受體的結(jié)合干擾TLR4、NF-κB 信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，參與機體的炎癥損傷，促進IL-6 等釋放［16］。NOS 高表達可在炎癥反應過程中催化機體合成大量NO，進一步導致IκBα 表達增加，進而抑制NF-κB 通路上介導的COX2 活性［17-18］。NF-κB 是調(diào)控免疫炎癥相關(guān)基因的重要轉(zhuǎn)錄因子，當細胞受外界炎癥因子刺激后，NF-κB 的抑制蛋白（IκBα）可發(fā)生磷酸化并降解，使NF-κB 活化并入核，誘導相關(guān)炎癥基因的表達導致發(fā)熱［19］。有研究表明，干酵母皮下注射引起大鼠發(fā)熱后可激活NF-κB p65 并入核起到轉(zhuǎn)錄作用，促進下丘腦COX2 mRNA 表達增加［20］。

本實驗結(jié)果表明，在造模8 h 后模型組大鼠體溫，血清及下丘腦中IL-1β、TNF-α、IL-6 及PGE2水平均升高；進一步實驗結(jié)果表明，疏風解毒膠囊抑制干酵母致發(fā)熱大鼠血清中MIP-1α 水平，下丘 腦NOS、NO 水平，下丘腦TLR4、NF-κB p65、IκBα 及COX2 蛋白表達，且呈劑量依賴性。

綜上所述，疏風解毒膠囊能降低酵母致熱模型大鼠體溫，其機制可能與抑制MIP-1α／TLR4／NF-κB p65／COX2／ PGE2通路有關(guān)。