益腎調(diào)經(jīng)方對卵巢儲備功能減退大鼠顆粒細胞凋亡的影響

嚴如根仇華何靜劉恭雪曹煥澤陳銀蔡平平李長忠

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南250355； 2.濟南市中醫(yī)醫(yī)院，山東 濟南250012； 3.盱眙縣中醫(yī)院，江蘇 淮安211700； 4.山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院，山東 濟南250012）

卵巢儲備功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）是女性在40 歲之前發(fā)生的卵巢內(nèi)卵母細胞質(zhì)量下降和（或）數(shù)量減少，伴隨體內(nèi)性激素紊亂，最終導致月經(jīng)異常及生育力下降［1-2］。DOR 病人如若延誤病情，失治誤治可最終演變成為卵巢早衰，嚴重干擾了女性的身心健康［3］。鑒于DOR 的發(fā)病機制尚不明確，目前西醫(yī)主要采用激素補充療法，雖然短期療效理想肯定，但長時間使用會刺激影響到患者的心臟、乳腺、子宮等器官，增加罹患心臟疾病、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、靜脈血栓等疾病的機率，因此患者的可接受度較低［4-6］。

中醫(yī)藥在調(diào)經(jīng)促孕方面的運用歷史悠久、療效突出，且無明顯毒副作用，2017 年中國關(guān)于早發(fā)性卵巢功能不全專家診治共識中就提到了中醫(yī)中藥可以作為改善卵巢功能的非激素治療［7］。益腎調(diào)經(jīng)方作為臨床經(jīng)驗用方，能夠有效改善患者的卵巢功能，保護女性生育力，但其具體作用機制尚不明確。本研究使用雷公藤多苷片混懸液灌胃構(gòu)建DOR 大鼠模型，探討益腎調(diào)經(jīng)方對DOR 大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的抑制作用及其對相關(guān)凋亡因子的影響，以期為DOR 的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 8 周齡SPF 級SD 雌性大鼠60只，體質(zhì)量（180±50）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）2019-0003。每籠5 只飼養(yǎng)于山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院SPF 級動物房（室溫21～25 ℃、相對濕度為50%～60%），自由飲水攝食，室內(nèi)照明由專人控制（晝夜12 h／12 h）。本研究所涉及的動物實驗均符合動物倫理委員會的準則（批準號2019-014）。

1.2 藥物 雷公藤多苷片（湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號Z43020138）；戊酸雌二醇片（德國拜耳公司，批號J20130009）；黃體酮膠囊（浙江仙琚制藥股份有限公司，國藥準字H20041902）；益腎調(diào)經(jīng)方由熟地黃12 g、當歸12 g、醋龜甲10 g、山藥20 g、酒萸肉12 g、酒蓯蓉20 g、醋香附15 g、黨參20 g、丹參15 g、黃芪20 g、枸杞子20 g、淫羊藿15 g、菟絲子20 g、八月札15 g 組成，本實驗主要采用中藥顆粒劑，益腎調(diào)經(jīng)方生藥共計226 g／劑，根據(jù)顆粒劑說明書與生藥等量換算，相當于免煎顆粒43.5 g／劑，中藥免煎顆粒由江陰天江藥業(yè)有限公司有償提供。

1.3 試劑 革蘭氏染色液（批號G1060）、蛋白提取試劑盒（批號BC3710）均購自北京索萊寶科技有限公司；TUNEL 染色試劑盒（批號G1501-50T）、RNA 提取試劑盒（批號G3013）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號G3330-100）、PCR 試劑盒（批號G3320-05）、內(nèi)參一抗（批號GB11002）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；蛋白濃度檢測試劑盒（批號P0012）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；caspase-3 一抗（批號66470-2-Ig）、Bax 一抗（批號60267-1-Ig）、Bcl-2 一抗（批號26593-1-AP）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 熒光定量PCR儀，瑞士羅氏公司；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀，美國伯樂公司；全波長酶標儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；化學發(fā)光成像儀，美國GE 公司；全自動真空組織脫水機，美國Thermo 公司；顯微鏡，德國徠卡公司。

2 方法

2.1 動物篩選及分組 60 只8 周齡SD 大鼠適應性喂養(yǎng)1周，接連3 個動情周期（12 d）陰道涂片，確定每只大鼠有正常的動情周期后，隨機挑選10 只設(shè)為空白組，其余50只隨機分成模型組，益腎調(diào)經(jīng)方高、中、低劑量組，激素序貫組，每組10 只。

2.2 動物造模 參考文獻［8］報道，大鼠連續(xù)14 d 灌胃給予雷公藤多苷片混懸液（50 mg／kg）進行造模，于造模第8 天起進行大鼠陰道涂片并用革蘭氏染色，如果涂片結(jié)果顯示動情周期≥6 天或停滯在某一時期≥3 天者，視為動情周期紊亂，并提示造模成功［9］。

2.3 給藥 建模成功后，參照人與大鼠之間藥物劑量換算方法進行計算［10］，益腎調(diào)經(jīng)方中劑量組灌胃給予人臨床等效劑量，即4.6 g／kg；益腎調(diào)經(jīng)方高、低劑量給予人臨床劑量2、0.5倍，即9.2、2.3 g／kg；激素序貫組灌胃給予戊酸雌二醇片（0.1 mg／kg）聯(lián)合黃體酮膠囊（21 mg／kg）；空白組、模型組給予等容量生理鹽水灌胃，連續(xù)給藥15 d，給藥結(jié)束后進行陰道涂片，于動情前期采血并取雙側(cè)卵巢組織待測。

2.4 檢測指標

2.4.1 陰道脫落細胞涂片 將耳鼻喉棉棒蘸取適量0.9%NaCl 溶液，輕輕放入大鼠陰道，順時針方向輕刮宮頸口1周，將含有陰道脫落細胞的分泌物均勻涂在玻璃載片上，干燥后使用革蘭氏染色鏡檢。正常大鼠動情周期分為以白細胞為主的動情間期、以有核上皮細胞為主的動情前期、以角化細胞為主的動情期以及三者兼具的動情后期，周期為4～5 d，規(guī)律且穩(wěn)定。

2.4.2 蘇木素-伊紅（HE）染色 大鼠卵巢組織置于4%多聚甲醛固定24 h 后脫水、石蠟包埋，連續(xù)切成約4 μm病理切片，進行漂片、攤片、烤片、HE 染色、透明并封片，于顯微鏡下觀察。

2.4.3 TUNEL 染色檢測大鼠卵巢顆粒細胞凋亡情況 取“2.4.2”項下制備的病理切片，按照TUNEL 染色試劑盒說明書操作，染色觀察大鼠卵巢顆粒細胞凋亡情況，細胞凋亡率＝（凋亡細胞數(shù)／細胞總數(shù)）×100%。

2.4.4 免疫組織化學技術(shù)（IHC）檢測大鼠卵巢組織caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達 取“2.4.2”項下制備的病理切片，經(jīng)切片、攤片、烤片、脫蠟、檸檬酸抗原修復、封閉、一抗及二抗孵化、DAB 顯色、蘇木素復染，封片后于顯微鏡下觀察。根據(jù)陽性細胞面積總和占視野面積的百分比進行統(tǒng)計分析。

2.4.5 Western blot 檢測大鼠卵巢組 織caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達 取部分卵巢組織，提取蛋白后并檢測濃度，蛋白煮沸變性，經(jīng)過配膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，一抗4 ℃孵育過夜，二抗搖床慢搖孵育1 h，TBST 清洗3次，每次15 min，ECL 法顯影。

2.4.6 RT-qPCR 檢測大鼠卵巢組織caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA 表達 取部分卵巢組織，按照試劑盒說明書步驟提取RNA，并測得RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄后選用GAPDH作為內(nèi)參，檢測caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA 表達情況，并通過擴增曲線得到CT值，以2-△△CT法進行相對定量分析，引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，如果檢驗樣本資料呈現(xiàn)正態(tài)性分布且滿足方差齊性，采用方差分析及t檢驗；不符合則采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 益腎調(diào)經(jīng)方對DOR 大鼠動情周期的影響 由表2 可知，與空白組比較，模型組大鼠動情周期停滯、延長或無明顯動情周期（P＜0.01），說明造模后大鼠體內(nèi)性激素分泌異常，抑制了大鼠卵巢功能；與模型組比較，經(jīng)過益腎調(diào)經(jīng)方及激素序貫給藥15 d后，大鼠紊亂的動情周期時間縮短，趨向規(guī)律（P＜0.05，P＜0.01）。大鼠各動情周期陰道脫落細胞學染色結(jié)果見圖1。

圖1 大鼠陰道脫落細胞學（×50）

表2 各組大鼠動情周期的比較（， n＝10）

表2 各組大鼠動情周期的比較（， n＝10）

注：與空白組比較，** P＜0.01；與模型組比較，＃ P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 益腎調(diào)經(jīng)方對DOR 大鼠卵巢病理變化的影響 如圖2所示，空白組大鼠卵巢的皮質(zhì)和髓質(zhì)在光鏡下清晰可見，皮質(zhì)下富含結(jié)構(gòu)和形態(tài)正常的各級卵泡及黃體，且間質(zhì)腺少見，髓質(zhì)內(nèi)的血管、神經(jīng)及淋巴管豐富，未見局部充血、變性壞死等病理變化；模型組大鼠可見卵巢皮質(zhì)增厚，各級生長卵泡均減少，閉鎖卵泡增加，間質(zhì)腺多見，髓質(zhì)萎縮；經(jīng)益腎調(diào)經(jīng)方及激素序貫給藥后，卵巢皮質(zhì)增厚減輕，各級生長卵泡均多于模型組，閉鎖卵泡及間質(zhì)腺少見，髓質(zhì)略萎縮。

圖2 各組大鼠卵巢組織病理變化（HE，×100）

3.3 益腎調(diào)經(jīng)方對DOR 大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響 與空白組比較，模型組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率降低（P＜0.01），見表3、圖3。

圖3 各組大鼠卵巢組織TUNEL 染色（×200）

表3 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較（， n＝10）

表3 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較（， n＝10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 免疫組化檢測大鼠卵巢組織caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達的變化 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織中caspase-3、Bax 表達均升高（P＜0.01），Bcl-2表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠卵巢組織中caspase-3、Bax 表達均降低（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2 表達升高（P＜0.05，P＜0.01），見表4、圖4。

圖4 各組大鼠卵巢組織中caspase-3、Bcl-2、Bax 表達（IHC，×200）

表4 各組大鼠卵巢組織中caspase-3、Bcl-2、Bax 陽性細胞面積占比（%，， n＝10）

表4 各組大鼠卵巢組織中caspase-3、Bcl-2、Bax 陽性細胞面積占比（%，， n＝10）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 Western blot 檢測大鼠卵巢組織caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達的變化 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織caspase-3、Bax 蛋白表達升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，益腎調(diào)經(jīng)方各劑量組大鼠卵巢組織caspase-3、Bax 蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖5～6。

圖5 各組大鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白條帶圖

3.6 益腎調(diào)經(jīng)方對DOR 大鼠卵巢組織Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織Bax、caspase-3 mRNA 表達升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠卵巢組織caspase-3、BaxmRNA 表達降低（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達升高（P＜0.05，P＜0.01），見圖7。

圖7 各組大鼠卵巢組織中Bax、 Bcl-2、 caspase-3 mRNA 表達（， n＝10）

4 討論

卵巢儲備功能減退（DOR）作為卵巢早衰的已病，而卵巢早衰作為卵巢儲備功能減退的未病，深入研究DOR，對于有效阻止和延緩卵巢早衰的發(fā)生具有重要意義，彰顯了中醫(yī)學“未病先防”“既病防變”的重要思想。經(jīng)驗方益腎調(diào)經(jīng)方緊扣DOR 脾腎虧虛為本，氣滯血瘀為標的重要病機，在施諸“補”“舒”法同時，輔以活血化瘀之法，臨床療效顯著。方中菟絲子、淫羊藿、肉蓯蓉溫補腎陽；龜板、熟地、枸杞子、山藥補腎養(yǎng)陰，寓有陰中求陽，陽中求陰之意；黃芪、黨參健脾益腎，益后天而養(yǎng)先天；丹參、當歸溫潤養(yǎng)血，化瘀調(diào)經(jīng)；八月札、香附理氣疏肝；山萸肉補益肝腎，諸藥聯(lián)用，共奏補腎健脾，疏肝活血之功。

顆粒細胞凋亡引發(fā)卵母細胞質(zhì)量下降，甚則導致卵泡閉鎖是形成DOR 的重要病理基礎(chǔ)［11-12］。顆粒細胞作為卵巢的最主要功能細胞，其與卵母細胞的相互交流對卵母細胞的發(fā)育和成熟起著不可替代的作用［13］。此外，顆粒細胞上含有卵泡賴以生長的卵泡刺激素和促黃體生成素受體，所以顆粒細胞的存在與否直接決定著卵泡的發(fā)育和閉鎖［14］。因此，本實驗從顆粒細胞凋亡角度出發(fā)探討益腎調(diào)經(jīng)方治療DOR 的作用機制。由于雷公藤多苷片的生殖毒性［15］，被廣泛應用于誘導DOR 大鼠模型［16-17］，結(jié)果證實其與人類DOR 臨床及組織學特征較為相符［18］。本研究采用雷公藤多苷片造模后，與空白組比較，模型組大鼠動情周期明顯紊亂，且大鼠各級生長卵泡及卵泡中的顆粒細胞層數(shù)明顯減少，表明本次實驗造模成功。

圖6 各組大鼠卵巢組織中Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達（， n＝10）

細胞凋亡指在基因嚴格控制下，由促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白和凋亡調(diào)控因子等共同參與的細胞程序性死亡，是機體重要的自我穩(wěn)態(tài)機制［19-20］。Bcl-2 屬于抗凋亡基因，是協(xié)調(diào)細胞生命和死亡的關(guān)鍵因子［21］；Bax 大多位于細胞質(zhì)，屬于促凋亡基因。正常情況下，Bax 與Bcl-2 可產(chǎn)生同源或者異源二聚體來控制細胞凋亡，但如果這種平衡關(guān)系被各種凋亡信號刺激破壞，就會發(fā)生細胞凋亡［22-23］。細胞凋亡的線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑都是經(jīng)過活化caspase 家族［24］，繼而影響底物蛋白，加速蛋白分解而觸發(fā)凋亡。caspase-3 作為細胞凋亡中的重要效應因子，其大多位于Ⅰ型細胞程序性死亡有序級聯(lián)反應下游，是caspase 家族中最關(guān)鍵的執(zhí)行者，通常認為caspase-3 是細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應的必由之路，其被激活預示著凋亡步入不可逆階段［25］。

本實驗結(jié)果表明，益腎調(diào)經(jīng)方可以有效改善DOR 大鼠的動情周期，增加DOR 大鼠各級生長卵泡及顆粒細胞。同時，其能提高DOR 大鼠卵巢組織中抗凋亡因子Bcl-2 的表達，降低促凋亡因子caspase-3、Bax 的表達。綜上所述，益腎調(diào)經(jīng)方可能通過影響DOR 大鼠卵巢中相關(guān)凋亡指標抑制顆粒細胞凋亡，阻止并延緩卵泡發(fā)生閉鎖，從而實現(xiàn)改善DOR 大鼠卵巢功能的目的。