化濁解毒疏肝方對戊四氮致癇模型大鼠學習記憶能力及AC-cAMPCREB 通路的影響

平鑫 秦少坤劉書寧蘆曄曹亞飛張延紅趙亞男裴林*張少丹

（1.河北省中醫藥科學院，河北 石家莊050031； 2.河北中醫學院，河北 石家莊050200； 3.河北醫科大學第二醫院，河北 石家莊050073）

癲癇是一種大腦神經元異常突發同步放電，導致出現中樞神經功能障礙的疾病。我國癲癇患者約有1 000萬［1］，而其中約30%癲癇患者出現了學習記憶能力障礙，嚴重降低患者的生活質量［2］。

癲癇患者發生學習記憶功能損傷的機制尚不明朗，且影響因素較復雜，目前較多研究認為其機制與神經遞質異常、腦組織受損、氧化應激等有關［3-6］。環磷酸腺苷（cAMP）是由激活腺苷酸環化酶（AC）催化腺嘌呤核苷三磷酸水解而生成，其核蛋白——環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）是產生轉錄變化的傳導因子，在調控信號通路中起到關鍵作用，其活化后參與了調節突觸可塑性和長期記憶形成的過程，在調節工作和學習記憶等生物學功能中發揮著重要作用［7-8］。

化濁解毒疏肝方，原名調肝解毒方，是基于“濁毒”理論研究的中藥復方，認為 “癇病”可歸因于風、火、痰、瘀、五臟功能失調，之后內化生毒并伏于腦絡，引發元神失控、癲癇抽搐。此方采用“化濁毒、調臟腑”的治則要點，通過觀察其改善癲癇大鼠學習記憶功能障礙的藥理效應并探索作用機制，以期為抗癲癇及改善學習記憶障礙的治療提供新的思路。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 雄性大鼠60只，體質量100～120 g，購自河北醫科大學動物實驗中心，飼養于正常規格聚砜鼠籠，室溫恒定于22 ℃，相對濕度60%。

1.2 試劑與藥物 化濁解毒疏肝方由黃芩12 g、柴胡12 g、絞股藍12 g、石菖蒲9 g、羅勒6 g、荷梗9 g 等組成，由安國市伊康藥業有限公司提供，批號190103。丙戊酸鈉片（批號181003，湖南省湘中制藥有限公司）；戊四氮（批號P6500-25G，美國Sigma-Aldrich 公司）；AC 兔抗大鼠多克隆抗體（批號TA322232，美國OriGene 公司）；cAMP 兔抗大鼠多克隆抗體（批號ab76238，英國Abcam 公司）；CREB、pCREB 兔抗大鼠多克隆抗體（批號9197、9198，美國Cell Signaling Technology 公司）；增強酶標山羊抗兔IgG、10%山羊血清、TA-09 β-actin、Western blot 魯米諾化學發光試劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）；BS-0061R β-actin（北京博奧森生物技術有限公司）。無水乙醇、二甲苯（天津市永大化學試劑有限公司）。

1.3 儀器 電子天平（德國Sartorius 公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）；微量加樣器（法國Gilson 公司）；RM2016 型切片機（德國Leica 公司）；KD-T 型攤烤片機（浙江省金華市科迪儀器設備有限公司）；高速離心機（德國Eppendorf 公司）；電泳儀和轉膜儀（北京六一儀器廠）；Morris 水迷宮、八臂迷宮（上海洛維生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 60 只大鼠隨機分為正常組，模型組，丙戊酸鈉組，化濁解毒疏肝方低、高劑量組，每組12 只。參考文獻［9］報道，除正常組外，其余各組大鼠均建立癲癇模型，每天腹腔注射戊四氮40 mg／kg，另設正常組，每天腹腔注射等體積生理鹽水，共28 d，腹腔注射后密切觀察大鼠癇性發作行為1 h。大鼠癇性發作評價采用Lado 分級標準［10］，見表1。造模周期內連續5 d 出現3.5級以上的癇性發作表現，即視為造模成功。28 d 造模結束后，第29 天進入灌胃給藥階段，給藥周期為4 周。化濁解毒疏肝方低、高劑量組大鼠每天灌胃給予藥物2.7、5.4 g／kg，丙戊酸鈉組大鼠每天灌胃給予藥物189 mg／kg，正常組和模型組大鼠每天灌胃給予生理鹽水10 mL／kg。

表1 Lado 分級標準

2.2 行為學測試

2.2.1 Morris 水迷宮實驗 末次給藥后第2天，通過Morris 水迷宮實驗開展學習能力和記憶能力測試。每組選取10 只大鼠，實驗開始后依次將大鼠從各個象限墻壁中心位置入水，要求120 s 內搜索水下隱藏平臺，待大鼠爬上平臺則單次測試結束。若時間截止大鼠仍未爬上平臺，則在下一次測試前將大鼠放置平臺上適應30 s。前4 天測試為定位航行實驗，記錄大鼠尋找平臺的逃避潛伏期，第5 天測試為空間探索實驗，當撤掉水下平臺后，記錄大鼠穿越原平臺位置的次數。

2.2.2 八臂迷宮實驗 Morris 水迷宮實驗完成后第2天，通過八臂迷宮實驗評估大鼠的空間學習記憶能力［11］。每組選取經過Morris 水迷宮實驗的10 只大鼠，在正式實驗開始前進行環境適應性訓練2 d，每天2次，每次訓練10 min，以便大鼠熟悉迷宮環境及建立攝食策略。為保證大鼠足夠的攝食動力，正式測試前所有大鼠均被禁食24 h。將八臂迷宮實驗的1、2、4、7 號臂放入飼料且固定為喂食臂。觀察大鼠10 min 內的攝食活動并記錄大鼠重復進入喂食臂總數為工作記憶錯誤次數，重復進入非喂食臂總數為參考記憶錯誤次數，兩者之和為總錯誤次數。每次測試結束后，將八臂迷宮實驗用75%乙醇擦拭、晾干，以防止氣味信號對大鼠的干擾作用。

2.3 免疫熒光法檢測海馬神經元AC、cAMP、CREB 表達 每組選取5 只經過行為學測試的大鼠，深度麻醉后解剖暴露心臟，從心尖處插管依次進行生理鹽水沖洗和4%多聚甲醛固定，全腦取材并石蠟包埋后，制備8 μm 的冠狀連續切片。腦切片在二甲苯中脫蠟后，依次在梯度乙醇中脫水，0.3%過氧化氫孵育?？乖崛〔捎?0%檸檬酸鈉緩沖液98 ℃加熱，冷卻后孵育山羊血清。組織切片用AC、cAMP、CREB 兔抗大鼠多克隆抗體孵育于4 ℃冰箱過夜。加入二抗避光孵育和DAPI 復染，封片。每1 個標本選取5個切片，每1 個切片隨機選取5 張視野圖像，觀察海馬CA1、CA3、DG 區的表達。

2.4 Western blot 法檢測海馬組織AC、cAMP、CREB、pCREB 的表達 每組另取5 只經過行為學測試的大鼠，麻醉處死后直接取腦，剝離海馬后稱定質量，并置于凍存管內標記，-80 ℃冷凍保存。取100 mg 腦組織，加入液氮研碎組織，研磨成液體狀，轉至EP 管后降溫并離心，標本取上清液胞漿蛋白，立即-80 ℃分裝冷凍保存。根據蛋白定量結果，加入組織總蛋白樣品與凝膠電泳上樣緩沖液，95 ℃變性10 min。將樣品加入凝膠孔中，接通電源并將樣品通過濃縮膠與分離膠。采用濕轉法將分離的蛋白條帶轉印至PVDF 膜上，分別孵育非標記一抗及辣根過氧化物酶標記二抗。化學發光法顯色，Image J 軟件分析灰度值，以β-actin 灰度值為內參，計算目標蛋白相對表達。

2.5 統計學分析 通過SPSS 20.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 化濁解毒疏肝方對大鼠癲癇發作情況的影響 與模型組比較，丙戊酸鈉組和化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠癲癇發作等級降低（P＜0.05，P＜0.01），各給藥組大鼠癲癇發作潛伏期延長（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 化濁解毒疏肝方對大鼠癲癇發作情況的影響（，n＝10）

表2 化濁解毒疏肝方對大鼠癲癇發作情況的影響（，n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與丙戊酸鈉組比較，＃＃P＜0.01；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，△△P＜0.01。

3.2 化濁解毒疏肝方對大鼠學習能力障礙的影響 各組大鼠在4 d 測試中的逃避潛伏期均有縮短趨勢。與模型組比較，正常組大鼠第3、4 天逃避潛伏期縮短（P＜0.05，P＜0.01），丙戊酸鈉組和化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠第4 天逃避潛伏期縮短（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

3.3 化濁解毒疏肝方對大鼠記憶能力障礙的影響 與模型組比較，正常組、丙戊酸鈉組、化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠穿越平臺次數增加（P＜0.01）；與丙戊酸鈉組比較，化濁解毒疏肝方低劑量組大鼠穿越平臺次數減少（P＜0.05），化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠穿越平臺次數增加（P＜0.05）；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠穿越平臺次數增加（P＜0.01），見表3、圖1。

表3 化濁解毒疏肝方對大鼠學習能力障礙、記憶能力障礙的影響（， n＝10）

表3 化濁解毒疏肝方對大鼠學習能力障礙、記憶能力障礙的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與丙戊酸鈉組比較，＃P＜0.05；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，△△P＜0.01。

圖1 各組大鼠穿越平臺活動軌跡圖

3.4 化濁解毒疏肝方對大鼠空間學習記憶能力的影響 與模型組比較，正常組、丙戊酸鈉組、化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠的工作記憶錯誤次數、參考記憶錯誤次數、總錯誤次數均減少（P＜0.01），化濁解毒疏肝方低劑量組大鼠總錯誤次數減少（P＜0.05）；與丙戊酸鈉組比較，化濁解毒疏肝方低劑量組大鼠的參考記憶錯誤次數、總錯誤次數增加（P＜0.05，P＜0.01），化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠的工作記憶錯誤次數、參考記憶錯誤次數、總錯誤次數均減少（P＜0.05，P＜0.01）；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠的工作記憶錯誤次數、參考記憶錯誤次數、總錯誤次數均減少（P＜0.01），見表4。

表4 化濁解毒疏肝方對大鼠的空間學習記憶能力的影響（， n＝10）

表4 化濁解毒疏肝方對大鼠的空間學習記憶能力的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與丙戊酸鈉組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，△△P＜0.01。

3.5 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經元AC、cAMP、CREB 表達的影響 與模型組比較，正常組、丙戊酸鈉組、化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠海馬神經元CA1 區、CA3 區、DG 區的AC、cAMP、CREB 表達均升高（P＜0.05，P＜0.01）；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠海馬神經元CA1 區、CA3 區、DG 區的AC、cAMP、CREB 表達均升高（P＜0.05，P＜0.01），見表5～7、圖2～4?；瘽峤舛臼韪畏降蛣┝拷M與模型組、丙戊酸鈉組、化濁解毒疏肝方高劑量組比較均無統計學意義，故不予對照圖示。

圖2 免疫熒光檢測大鼠海馬組織中AC 的表達

表5 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經元AC 表達的影響（， n＝5）

表5 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經元AC 表達的影響（， n＝5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與丙戊酸鈉組比較，＃P＜0.05；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

表6 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經元cAMP 表達的影響（， n＝5）

表6 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經元cAMP 表達的影響（， n＝5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與丙戊酸鈉組比較，＃P＜0.05；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，△△P＜0.01。

表7 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經元CREB 表達的影響（， n＝5）

表7 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬神經元CREB 表達的影響（， n＝5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，△P＜0.05。

3.6 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬組織AC、cAMP、CREB、pCREB 蛋白表達的影響 與模型組比較，正常組、丙戊酸鈉組、化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠海馬組織AC、cAMP、CREB、pCREB 蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01）；與化濁解毒疏肝方低劑量組比較，化濁解毒疏肝方高劑量組大鼠海馬組織 AC、cAMP、CREB、pCREB 蛋白表達升高（P＜0.05），見圖5。

圖3 免疫熒光檢測大鼠海馬組織中cAMP 的表達

圖4 免疫熒光檢測大鼠海馬組織中CREB 的表達

圖5 化濁解毒疏肝方對大鼠海馬組織AC、cAMP、CREB、pCREB 蛋白表達的影響（， n＝5）

4 討論

戊四氮化學點燃致癲癇是經典的慢性癲癇發作模型，表現為降低神經系統功能，使中樞神經系統興奮性不斷升高，同時連續降低癲癇發作閾值［12］。學習記憶能力障礙的主要表現為長時與短時學習記憶功能受損，注意力不集中，思維活動緩慢，對事物的感知能力減退等多方面功能損傷［13］。其病理機制可能是由于反復癇性發作，大腦發生不同程度的缺氧、代謝紊亂、興奮性神經遞質過度釋放、組織酸中毒等現象，或出現神經組織結構變異而導致的［14］。

本研究采用Morris 水迷宮實驗和八臂迷宮實驗作為評估癲癇大鼠空間及工作學習記憶能力的行為學實驗方法［15-16］，發現癲癇發作若得以控制，學習記憶障礙也會得到改善。與正常組比較，模型組大鼠表現出癇性抽搐、驚厥癥狀，癲癇發作后，其學習記憶能力同時降低；給予化濁解毒疏肝方后，大鼠的行為學測試結果有明顯提升。

海馬組織歸屬于大腦的邊緣系統，是大腦中反映長短時學習記憶、空間定位、聲光反應等行為能力的重要功能區域，其中的CA1、CA3、DG 區是癲癇領域研究的主要觀察部位［17-18］。海馬與癲癇的發生發展密切相關，嚙齒類動物反復癇性發作會降低海馬信息處理的突觸可塑性，對海馬組織的長期記憶功能產生損傷［19］。研究發現，AC-cAMPCREB 通路與學習記憶領域的關系密切，其中cAMP 作為傳遞生命活動信息的“第二信使”，具備調節胞內物質代謝、修復和活化腦細胞的功能。當具有記憶功能的cAMP 核內蛋白CREB 被激活，與突觸可塑性長時程增強產生和長時記憶鞏固密切相關［20］，它不僅介導短時記憶向長時記憶的轉變，還可促進維持長時記憶形成，或激活其相關基因表達，尤其是磷酸化的CREB 轉錄活性的增強［21-22］。

丙戊酸鈉是傳統抗癲癇藥物中的臨床一線用藥，有研究證實其對癲癇所伴隨的學習記憶能力損傷具有改善作用［23］。本實驗研究發現，與正常組比較，模型組大鼠由于反復癲癇發作損傷導致AC-cAMP-CREB 通路相關蛋白表達降低；與模型組比較，經化濁解毒疏肝方和丙戊酸鈉給藥后，大鼠相關蛋白表達均升高，其中高劑量化濁解毒疏肝方的表達更為突出，這表明該方可以升高AC-cAMP-CREB通路蛋白表達，進而上調CREB 轉錄水平改善了癲癇大鼠的學習記憶行為活動。同時也提示化濁解毒疏肝方改善癲癇大鼠學習記憶損傷的作用可能是參與上調AC-cAMPCREB 通路信號表達有關。

機體若有五臟失調，加以風火痰瘀邪氣蘊聚膠結，可內發毒邪，伏藏于腦，損腦傷神則誘發癇病昏仆抽搐，此屬“濁毒證”范疇［24］。本研究采用化濁解毒疏肝方，可達清濕熱、化濁毒、理氣機、調臟腑之效，遂使癇病邪去，氣血調和，益腦養神，學習記憶損傷得以恢復。該方已在臨床研究中驗證對癲癇患兒發作情況及神經功能具有改善作用，尤其是明顯改善患兒的認知功能［25］，故深入探究該方的作用機制將有益于對癲癇患者的臨床治療。

綜上所述，化濁解毒疏肝方在控制癲癇發作的同時可有效改善癲癇大鼠學習記憶損傷，其作用機制可能是通過調節AC-cAMP-CREB 通路相關蛋白的表達進而改善突觸可塑性，提升了學習記憶能力。