高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃瓜中的4種甜味劑

周慧敏

（大連市檢驗檢測認(rèn)證技術(shù)服務(wù)中心，遼寧大連116630）

甜味劑是賦予食品甜味的一種食品添加劑[1]。目前甜味劑種類很多，按其來源可分為天然甜味劑和人工合成甜味劑。常見的人工合成甜味劑有阿斯巴甜、安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、紐甜和三氯蔗糖等。其中阿斯巴甜、安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素也屬于功能性高倍甜味劑，也叫非營養(yǎng)性甜味劑，其甜度均為蔗糖甜度的10倍以上。這幾種甜味劑因甜度高、用量少，常使用于糕點、醬腌菜、飲料、調(diào)味品和配制酒等食品中。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760－2014）明確規(guī)定了各種人工合成甜味劑在各類食品中的使用限量，但人工合成甜味劑在新鮮蔬菜上是不得使用的。人工合成甜味劑在限量范圍內(nèi)使用是安全的，但若長期過量使用會對人體產(chǎn)生一定危害[2]。

目前，甜味劑的檢測方法有液相色譜法[3]、液相色譜-質(zhì)譜[4]、離子色譜法[5]、氣相色譜法[6]和氣相色譜—質(zhì)譜法，但沒有蔬菜中多種甜味劑的檢測方法。本文選擇了阿斯巴甜、安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素4種典型的功能性高倍甜味劑，建立檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純），甲酸（色譜純），實驗用水為超純水。阿斯巴甜、安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素均為1 000 μg/mL。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6495 液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；Centrifuge 5804 R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)（德國Merck公司）；T18 均質(zhì)機（德國IKA公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

稱取樣品約2 g置于50 mL離心管中，加入20 mL超純水后用均質(zhì)機勻漿，10 000 r/min 離心5 min，上清液過0.2 μm微孔水相濾膜后收集于進樣瓶中，待上液質(zhì)聯(lián)用儀檢測，進樣量2 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別移取1 000 μg/mL的阿斯巴甜、安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素100 μL于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，得到1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用水將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋得到1 ng/mL、5 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL和100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。混合標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進樣，進樣量2 μL。

1.3.3 樣品測定

（1）色譜條件。色譜柱：Poroshell 120EC-C18；柱溫：室溫；流動相：A為超純水（含0.1%甲酸），B為甲醇；液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。電離方式ESI-，監(jiān)測模式MRM，離子源溫度200 ℃，離子噴霧電壓3 000 V，各組分定性定量離子對等參數(shù)，見表2。

表2 各組分的質(zhì)譜檢測參數(shù)及液相保留時間

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

將1 μg/mL的混合標(biāo)液，利用針泵進樣，找到各組分母離子和子離子以確定MRM離子對，優(yōu)化碰撞能，結(jié)果見表2。確定最優(yōu)質(zhì)譜檢測條件后進一步優(yōu)化液相色譜條件，色譜柱：Poroshell 120EC-C18；柱溫：室溫；流動相：A為超純水（含0.1%甲酸），B為甲醇；流速：0.3 mL/min；液相色譜梯度洗脫程序見表1。儀器條件優(yōu)化后目標(biāo)化合物離子色譜圖見圖1，各組分達到完全分離，滿足實驗條件。

圖1 目標(biāo)化合物總離子色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.3.2的方法配制標(biāo)準(zhǔn)序列濃度，以1.3.3的儀器條件進樣。在1～100 ng/mL選定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，用各組分的峰面積對質(zhì)量濃度作圖，得到線性相關(guān)系數(shù)和線性方程，將40 ng/mL濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進樣6次的峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。

表3 4種甜味劑保留時間、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.2.2 方法定量限

選一空白樣品，按1.3.1實驗步驟做加標(biāo)回收實驗，添加濃度從0.1 mg/kg逐漸稀釋，當(dāng)添加水平至0.01 mg/kg時，回收率均值為70.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差6.2%，滿足實驗要求，再降低添加濃度得到回收率均值，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不符合實驗要求，確定0.01 mg/kg為定量限。《出口食品中六種合成甜味劑的檢測方法》（SN/T 3538—2013）中采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進行檢測，甜蜜素、安賽蜜、糖精鈉和阿斯巴甜的測定低限均為1.0 mg/kg[7]；《食品中環(huán)己基氨基磺酸鈉的測定》（GB 5009.97—2016）中的液相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法甜蜜素的檢出限最低為0.03 mg/kg，本方法的檢出限均低于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、國標(biāo)方法檢出限，說明本檢測方法靈敏度較高[8]。

2.3 回收率和精密度

用不含有4種甜味劑的黃瓜做基質(zhì)進行加標(biāo)試驗，分別添加0.05 mg/kg、0.20 mg/kg、0.40 mg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每濃度6份平行樣本，按照1.3步驟處理并檢測，檢測結(jié)果見表4，各組成分回收率在加標(biāo)回收率在82.1%～98.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～5.8%。滿足檢測要求。

表4 4種甜味劑的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論與討論

黃瓜是常見的生食蔬菜，本身甜度較低，為了防止商家為增強黃瓜的甜度采用浸泡等方式違法添加一些人工合成的甜味劑，本文建立了黃瓜中人工合成甜味劑的檢測方法。人工合成甜味劑種類繁多，考慮阿斯巴甜、安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素甜度高、用量少、使用率較高，本方法選擇這4種甜味劑進行檢測。

本方法以超純水作為萃取試劑，通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，采用電噴霧負(fù)離子化模式（ESI-）和多反應(yīng)檢測，外標(biāo)法定量，同時測定黃瓜中阿斯巴甜、安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素4種甜味劑。結(jié)果表明，該方法可準(zhǔn)確測定黃瓜中阿斯巴甜、安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素4種甜味劑，其相關(guān)系數(shù)均大于0.99，定量限均為0.01 mg/kg，加標(biāo)回收率在82.1%～98.2%，從而確認(rèn)本方法可準(zhǔn)確、快捷測定黃瓜中阿斯巴甜、安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素4種甜味劑。