豬肉中環丙沙星殘留檢測的不確定度評定

杜春雷

（張家口市農產品質量安全監督檢驗中心，河北張家口 075000）

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

環丙沙星標準物質 [（100±0.10） μg/mL]：農業部環境保護科研監測所；液相色譜-質譜聯用儀：G6470，安捷倫；分析天平：LE2002E，梅特勒；移液器：5 ～ 50 μL、100 ～ 1 000 μL，Thermo。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

（1）環丙沙星中間液配制。用移液器移取1 mL環丙沙星至10 mL容量瓶，乙腈定容，濃度為10 μg/mL。

（2）環丙沙星工作液配制。用移液器移取1 mL標準中間液至10 mL容量瓶，乙腈定容，濃度為1 000 ng/mL。

（3）基質標準工作曲線。用移液器分別移取20 μL、50 μL、100 μL、200 μL、500 μL 和 1 000 μL工作液至10 mL容量瓶，豬肉空白基質定容，濃度分別為2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL。

1.2.2 樣品前處理

稱取豬肉樣品5.0 g，加20 mL 0.1 mol/L EDTAMcllvaine緩沖溶液，渦旋1 min，超聲10 min，10 000 r/min離心5 min（4 ℃），提取3次，合并上清液。將待凈化的上清液全部轉移到已活化的HLB柱（200 mg，6 mL），棄去濾液，用2 mL 5%甲醇水淋洗，抽干小柱，用6 mL甲醇洗脫并收集。氮氣吹干，用1 mL 0.2%甲酸水復溶，渦旋1 min，過0.22 μm濾膜，上機測定[1]。

1.2.3 色譜條件

C18色譜柱：50 mm×2.1 mm，1.9 μm；柱溫：40 ℃，流速：0.2 mL/min；流動相：乙腈-0.2%甲酸水。

1.2.4 質譜條件

電離模式：ESI+；掃描方式：MRM；離子噴霧電壓：500 V；離子化溫度：300 ℃[2]。

1.3 結果計算

環丙沙星的計算公式如下：

式中：X為樣品中組分含量，μg/kg；c為測定液中組分濃度，ng/mL；V為定容體積，mL；m為樣品質量，g。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

不確定度的來源分析如圖1所示。

圖1 測定豬肉中環丙沙星的不確定度來源

2.2 不確定度的評定

2.2.1 樣品稱量引入的相對標準不確定度ur(W樣)

根據天平檢定證書，當稱量5.00 g時，最大允許誤差為0.02 g，假設均勻分布，試驗稱量樣品的平均質量為5.02 g，則樣品稱量引入的相對標準不確定度為：

2.2.2 樣品溶液定容引入的相對標準不確定ur(V樣)

樣品溶液定容使用1 000 μL移液器，根據《移液器檢定規程》，移液器的容量允差為0.000 2 mL，假設均勻分布，則樣品溶液定容引入的相對標準不確定度為：

2.3 儀器引入的相對標準不確定度ur(E液質)

根據液質校準證書，峰面積測量重復性為1.2%，假設均勻分布，則儀器引入的相對標準不確定度為：

2.4 測量重復性引入的相對標準不確定度ur()

平行制備10份樣品進行測定，結果見表1。由表1可知，測量重復性引入的相對標準不確定度為：

表1 樣品檢測結果

2.5 回收率引入的相對標準不確定度ur(R)

對加標樣品進行測定，回收率分別為93.52%、94.22%、95.36%、93.18%和92.40%。根據t檢驗，則回收率引入的相對標準不確定度為：

當置信度為95%，n-1=4，查t值臨界值表：t（0.05，4）=2.776，與13.69相比，需要回收率校正[3]。

2.6 標準溶液純度引入的相對標準不確定度ur(P標)

環丙沙星標準溶液不確定度為0.10 μg/mL，按均勻分布，標準溶液純度引入的相對標準不確定度為：

2.7 標準工作曲線配制引入的相對標準不確定度ur(V標)

配制過程使用容量瓶8次（10 mL）、1 000 μL移液槍（分別移取 100 μL、200 μL、500 μL 各 1 次，1 000 μL 3次），50 μL 移液槍（分別移取 20 μL、50 μL各1次），依據《常用玻璃量器檢定規程》和《移液器檢定規程》，假設均勻分布[4]，結果見表2。

表2 玻璃量器和移液器引入的不確定度

2.8 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度ur(C標)

配制6種濃度，每個濃度測定1次，見表3。計算標準溶液峰面積殘差的標準差，m為每個濃度檢測次數，m=1；n為標準曲線濃度點數[5]，n=6。

表3 標準曲線測量數據

標準溶液工作曲線配制過程引入的相對標準不確定度為：

式中：a為線性方程斜率；p為樣品溶液檢測次數，平行樣為2；n為標準溶液檢測總次數，6×1=6；為樣品溶液濃度平均值，51.19 ng/mL；C—為標準曲線配制濃度平均值，31.167 ng/mL；C實為標準溶液實測濃度，ng/mL。

2.9 擴展不確定度

環丙沙星的合成相對標準不確定度ucr(X)和合成不確定度uc(X)計算如下：

擴展不確定度U=k·uc(X)，取包含因子k=2，擴展不確定度U=1.75 μg/kg。

3 結論

測定豬肉中環丙沙星殘留量的不確定度影響因素包括儀器的穩定性、標準溶液純度和配制以及前處理重復性等。通過評定發現，其中影響最大的為標準曲線擬合，試驗中可以通過增加標準曲線檢測次數、標準曲線點數等，減小標準曲線擬合引入的不確定度，進而減小最終結果的不確定度，提高實驗準確性。