酶促水解制備豬腦抗氧化活性肽

盧文靜 ,陳佳佳 ,諶迪 ,葉沁 ,肖朝耿? ,黃光榮 ,張治國,周天瓊

(1.浙江省農業科學院 食品科學研究所,浙江 杭州 310021;2.中國計量大學 生命科學學院,浙江 杭州 310018;3.杭州華津藥業股份有限公司,浙江 杭州 311241)

豬腦不僅鮮嫩可口、營養豐富,還可以増加機體的免疫力,是傳統的健腦食品。豬腦含有豐富的蛋白質,約占新鮮豬腦的10%[1-2]。研究者從動物腦組織中分離蛋白質,采用酶法水解成游離的氨基酸和低分子水解物,用來治療腦相關的疾病[3]。豬腦多肽水解產物具有促進腦代謝等功效,能夠提高腦組織無氧代謝的ATP 生成量,減少氧自由基生成及類似神經生長因子刺激激素生成等[4]。早在20 世紀,我國就已開發出鎮腦寧等以豬腦為原料的中藥制劑用于治療頭痛。此外,由豬腦制備的腦活素已在臨床上廣泛應用40 a,它是75%游離氨基酸和25%短鏈肽的混合物,短肽可能是其生理活性成分[5]。張文治等[6]研究發現,采用乳豬制備的腦活性多肽與價格昂貴的進口腦活素發揮類似作用。豬腦水解物可顯著增強小鼠的學習記憶能力[7],其中水解物的活性短肽可作為類似內源神經營養因子緩解脊髓型頸椎病[8]。此外,豬腦多肽保護神經元防止大腦損傷,而很多神經性疾病的產生與活性氧等自由基相關[9]。

近年來,抗氧化肽逐漸成為研究熱點。特別是通過生物酶解法制備抗氧化肽,具有專一性強、反應條件溫和、反應過程容易控制、對環境友好和無毒性物質產生等優點。目前生物酶解法制備抗氧化肽已廣泛應用于動植物源抗氧化肽的制備[10-13]。通過酶解制備的生物活性肽不僅具有抗氧化活性,其抗菌、免疫調節等功能也有文獻報道[14-16]。豬腦酶解多肽目前主要被用于治療腦功能障礙疾病,如奧地利生產的腦活素 (Cerebrolyzin)、日本生產的Ceremon 及德國、羅馬尼亞生產的Crelizin 都是通過酶水解腦蛋白水解物獲得的制劑[5]。豬腦酶解物能抑制脂質過氧化、降低脂質過氧化物丙二醛的含量,改善β-淀粉樣誘導的小鼠空間記憶力損傷[17]。吳科鋒等[18]采用堿化酶法制備豬腦多肽,發現多肽分子量主要集中在250～2 000 u,且能減輕H2O2誘導的PC12 細胞毒性作用,降低活性氧生成,對氧化損傷具有保護作用。雖然已有文獻報道了酶解豬腦多肽抗氧化的活性,但基于抗氧化活性優化豬腦多肽制備的研究很少。因此,本文采用食品工業常用的生物酶,以酶解率為指標,篩選出豬腦生物酶解適用酶,隨后采用超濾截留不同分子量的多肽,考查酶解液不同組分多肽的總抗氧化活性,以總抗氧化活性為指標通過正交法優化酶解工藝,以期為豬腦抗氧化肽的制備提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

新鮮豬腦 (購自農貿市場);Novozym 37071、Pectinex UF、Celluclast 1.5 L (700 U·g-1)、Flavourzyme 500 MG (500 LAPU·g-1)、Neutrase 0.8 L (0.8 AU·g-1)、Alcalase 2.5 L (2.5 AU·g-1)、Alcalase 2.4 L (2.4 AU·g-1)、Alcalase 3.0 T (3.0 AU·g-1)、Palatase 2 000 L (脂肪酶,20 000 U·g-1) 和Ban 480 L (淀粉酶,480KNU-B·g-1),諾維信 (中國) 生物技術有限公司;木瓜蛋白酶 (100 000 U·g-1),南寧龐博生物工程有限公司;胰蛋白酶 (1∶250) 和胃蛋白酶 (1∶30 000),上海源葉生物科技有限公司;標準牛血清蛋白,生工生物工程 (上海) 股份有限公司;總抗氧化能力試劑盒,碧云天生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 主要儀器與設備

5424R 冷凍離心機,德國Eppendorf 公司;Spectra MAX190 全波長酶標儀,美國MD 公司;超濾設備,美國Millipore 公司;pH 計,上海三星儀器有限公司;ULTRA-TURRAX T1.8basic 勻漿機,德國IKA 公司;電熱恒溫水浴鍋,上海精宏實驗設備有限公司;粉碎機,德清拜杰電器有限公司;烘箱,上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 豬腦多肽水解酶的篩選

新鮮豬腦自然解凍后,除去血塊和腦膜 (軟腦膜和蛛網膜),用生理鹽水沖洗干凈,均質機勻漿得到豬腦勻漿,密封于冰箱中冷藏儲存備用[19]。準確稱取豬腦勻漿1.00 g,置于250 mL 錐形瓶中,加入200 mL 去離子水,磁力攪拌30 min,根據表1 進行酶解,酶解率計算公式為:酶的水解率=(酶解后水溶性蛋白含量-酶解前水溶性蛋白含量) ×酶解液體積÷豬腦的質量×100%。

表1 13 種酶的酶解環境

1.2.2 豬腦多肽含量測定

豬腦多肽含量測定采用Bradford 法測定并作適當修改[20]:取標準品牛血清蛋白制備濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg·mL-1梯度濃度牛血清蛋白溶液,取50 μL 上述標準液于96 孔板中,加入200 μL 考馬斯亮藍G250,混勻,室溫靜置10 min,檢測595 nm 處吸光值。以吸光值為縱坐標,牛血清蛋白質濃度為橫坐標,繪制標準曲線。待測品的制備:取合適濃度的樣品50 μL于96 孔板中,加入200 μL 考馬斯亮藍試劑,混勻,靜置10 min,檢測595 nm 處吸光值,根據回歸方程計算蛋白質含量。

1.2.3 酶解多肽分子量的超濾分離

將酶解液于Millipore 超濾裝置中利用截留量分子依次為5 和1 ku 截留模塊超濾10 min,制備得到3 種分子量范圍多肽,即>5 ku、1～ 5 ku 和<1 ku 的多肽。

1.2.4 酶解多肽抗氧化活性測定方法

不同酶解液的總抗氧化能力測定參考碧云天ABTS 總抗氧化能力試劑盒說明書。將檢測緩沖液、ABTS 溶液和1/1 000 過氧化氫溶液按152∶10∶8 的比例配制新鮮ABTS 工作液;把10 mmol Trolox 標準溶液 稀釋成 0.15、0.3、0.6、0.9、1.2 和1.5 mmol。在96 孔板每個檢測孔加入20 μL 過氧化物酶的工作液,空白對照孔中加入10 μL 蒸餾水;標準曲線檢測孔內加入10 μL 各種濃度的Trolox 標準溶液;樣品檢測孔內加入10 μL 各種待測樣品,混勻后每個孔內加入170 μL ABTS 工作液,輕輕混勻后室溫孵育6 min 后酶標儀于414 nm處進行測定。根據標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力。總抗氧化能力計算公式為:總抗氧化能力(mmol·g-1)=Trolox 當量濃度 (mmol) ÷樣品蛋白濃度 (mg·mL-1) ×稀釋倍數。

1.2.5 豬腦抗氧化活性肽提取工藝優化

通過單因素試驗發現,豬腦抗氧化活性肽的酶解工藝受到加酶量、pH、酶解溫度和酶解時間的影響較大。為了優化抗氧化活性肽酶解工藝,采用L9 (34) 正交試驗優化豬腦抗氧化活性肽提取工藝中胰蛋白酶加入量、pH、酶解溫度以及酶解時間。各因素1、2、3 水平分別為:胰蛋白酶加入量20、25、30 mg;pH 7.0、7.5、8.0;酶解溫度40、45、50 ℃;酶解時間 3、4、5 h。

1.2.6 數據統計

試驗結果通過SPSS 18.0 軟件分析,組間差異比較采用One-way ANOVA 檢驗來比較其差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 13 種酶水解率大小關系

由圖1 可得,對于上述13 種酶,可以發現胃蛋白酶的水解率顯著高于其他12 種酶,其次為Ban 480 L;Palatase 2 000 L 的水解率稍高于胰蛋白酶,但二者之間沒有顯著性差異;木瓜蛋白酶、Alcalase 3.0 T、Alcalase 2.4 L 和Neutrase 0.8 L 的水解率之間也沒有顯著性差異,水解率次于胃蛋白酶、Ban 480 L、胰蛋白酶和 Palatase 2 000 L;Novozym 37071、Pectinex UF、Celluclast 1.5 L、Flavourzyme 500 MG 和Alcalase 2.5 L 之間的水解率無顯著性差異,水解率均低于其他酶。對生產常用的13 種酶進行篩選,結果發現,豬腦采用一步法酶解制備抗氧化肽的過程中,水解率較高的有胃蛋白酶、Ban 480 L、Palatase 2 000 L 和胰蛋白酶。

圖1 13 種酶酶解豬腦蛋白的水解率

2.2 不同分子量酶解物的總抗氧化能力

對胃蛋白酶、Ban 480 L、Palatase 2 000 L 和胰蛋白酶4 種酶的酶解液進行超濾處理,觀察4 種酶各個組分的抗氧化情況。根據ABTS 法試劑盒說明書,總抗氧化能力標準曲線結果見表2。

表2 標準Trolox 溶液吸光值

總抗氧化能力標準曲線制備:以Trolox 濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,求得回歸方程,其中y=-0.678 7x+1.050 8,R2=0.998 5。

4 種酶解液通過截留分子量為5 和1 ku 截留模塊超濾后,沒有發現分子量>5 ku 的組分,說明4種酶解液水溶性成分的分子量主要分布在5 ku 以下。圖2 可得,除Ban 480 L 外,其他3 種酶中分子量<1 ku 組分的總抗氧化能力顯著高于1～5 ku組分;胰蛋白酶分子量<1 ku 組分的總抗氧化能力顯著高于另外3 種酶。雖然Palatase 2 000 L 的總抗氧化能力稍高于胃蛋白酶,但二者之間無顯著差異。而對Ban 480 L 來說,不論其分子量<1 ku 組分還是1～5 ku 組分,其總抗氧化能力均為最低。本研究結果發現,抗氧化活性肽主要集中在分子量<1 ku 的部分,這與Zhang 等[5]發現低分子量的短鏈豬腦多肽具有顯著的生物活性報導相似。

圖2 4 種酶超濾物的總抗氧化能力

2.3 正交試驗結果

根據因素與水平,以總抗氧化能力為指標優化提取工藝。本試驗研究了對豬腦抗氧化活性肽酶解工藝影響較大的4 個因素,即胰蛋白酶的加酶量、pH、酶解溫度、酶解時間。影響酶解工藝的主次因素依次是酶解時間、pH、酶解溫度、加酶量。較優水平是酶解時間3 h,pH 為7.0,酶解溫度為40 ℃,加酶量為20 mg,在最適條件下,總抗氧化能力為17.03 mmol·g-1。

3 小結與討論

本試驗以酶的水解率為指標,對豬腦蛋白水解工藝所用酶種類進行篩選,發現胃蛋白酶、Ban 480 L、Palatase 2 000 L 和胰蛋白酶4 種酶的酶解率相對較高。針對上述4 種酶的酶解液進行超濾處理,發現酶解液以分子量<1 ku 和1～5 ku 組分為主,且豬腦抗氧化活性肽很可能集中于分子量<1 ku 組分。為了提高豬腦抗氧化活性肽的總抗氧化能力,基于加酶量、酶解時間、酶解溫度、pH設計正交試驗,最終得到的較優水平為酶解時間3 h,pH 為7.0,酶解溫度為40 ℃,加酶量為20 mg,此時的總抗氧化能力為17.03 mmol·g-1。本試驗可為豬腦多肽的生物活性研究及高值化利用提供參考。