兼性貧營養凈水菌株微膠囊的制備及其性能研究

邱錦鳴，劉 哲，吳佳佳，薛陳杰，劉雪梅

（淮陰工學院化學工程學院，江蘇 淮安 223003）

貧營養微生物又稱為寡營養微生物，能夠在土壤、湖泊河水、地下水、沙表土等有機質匱乏的環境中生長［1］。將貧營養微生物從環境中分離提純出來，用于自來水工藝中低濃度溶解性污染物的去除，這是近年來在給水處理領域形成的一個新思路［2，3］。

研究表明，自來水深度處理工藝中存在自然條件下形成的菌落，其對水質提升具有積極作用，但自然形成菌落世代周期長，凈水效率低［4］。通過人工篩選的優勢菌群投放可顯著縮短生物掛膜過程，并有針對性地對靶向污染指標實施高效凈化。當前中國的集中式飲用水水源地微污染形勢十分嚴峻，自來水廠對溶解性污染物去除率亟待提高，積極研發貧營養凈水微生物制劑，將實驗室成果盡快產業化具有重要而迫切的現實意義［5，6］。

微囊化技術可以通過一定的理化手段將益生菌包裹在微小且封閉的膠囊中，不僅能在加工或貯藏過程中提高菌株的有效活菌數，還能在不利環境中對菌株進行保護，提高其抗性［7，8］。由于Ca2＋-藻酸鹽凝膠的安全和無毒性質，是最常用的微囊化壁材［9］。本研究利用淮陰工學院凈水微生物制劑研發課題組前期篩選出的兼性貧營養凈水碳源微生物菌株，將多菌株復配，采用乳化法制備微生物制劑，并研究其在微污染水體中的凈化效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

復配兼性貧營養菌株包括變形桿菌（Proteus）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），由淮陰工學院凈水微生物制劑研發課題組優選并經16S RNA 進行基因測序鑒定；MRS 培養基，宜興市永信生物有限公司；其他試劑均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司提供。

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-75KBS 型），上海申安醫療器械廠；高速冷凍大容量離心機（ST16R型），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-1D 型），蘇州博萊爾凈化設備有限公司；TOC 測定儀（M5310C 型），蘇伊士水務技術（上海）有限公司；紫外分光光度計（752 型），上海美析儀器有限公司；激光粒度分析儀（MS-2000 型），英國馬爾文儀器有限公司；掃描電鏡（Hitachi 型），日立科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的配制 將保藏在冰箱中的菌種在固體培養基上劃線，于37 ℃培養箱中培養12 h，挑選單菌落接種于液體培養基中，在振蕩培養箱中37 ℃培養24 h。4 ℃、4 000 r/min 離心15 min 分離菌懸液。菌泥用0.9%生理鹽水懸浮后，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，洗滌2 次，用生理鹽水懸浮細胞，將濃縮菌液濃度調節至1010CFU/mL，4 ℃冰箱保存。

1.2.2 乳化法制備微膠囊 采用外源乳化法，將菌懸液、滅菌的海藻酸鈉溶液（30 mg/mL）和含有（2 μL/mL）Tween-80 的植物油按照2∶3∶25（V/V）的比例混合，按200 r/min 對混合液進行攪拌，待乳化完全后，加入100 mL 滅菌CaCl2溶液（20 mg/mL），繼續攪拌20 min。350 r/min 離心5 min，4 ℃條件下收集微膠囊，用滅菌生理鹽水清洗2 次除去殘余的CaCl2。將微膠囊放入-20 ℃冰箱中預凍2 h 后，置于-40 ℃，5.9 Pa 真空冷凍干燥機中冷凍干燥24 h，得到微膠囊凍干粉。

1.2.3 微膠囊理化性質表征

1）外觀形貌測定。將樣品均勻分散在無水乙醇介質中，取少量分散液滴在超薄碳膜上，待乙醇揮發后，在200 kV 電子加速電壓下進行測試。

2）粒徑分析。以去離子水為分散介質，對微膠囊的粒徑大小及其分布進行測試。

3）微膠囊耐酸堿性的測定。錐形瓶中加入100 mL 去離子水，通過加鹽酸和氫氧化鈉調節pH從2 到12，分別加入原菌懸液和微膠囊，控制原菌懸液中的菌量，使其與微膠囊中含菌量相同。處理2 h后，測其活菌數并比較其耐酸堿性能力。

4）微膠囊定儲存穩定性試驗。根據經典恒溫法的指數理論，將未微膠囊化的菌種和微膠囊化的菌種置于恒溫57 ℃、相對濕度60%～65%條件下儲存7 d，相當于室溫下儲存1 年，測其活菌數的變化。

5）凈水試驗。取淮陰工學院湖水，用脫脂棉過濾，除去湖水中的懸浮物，得到有機質均一的水作為試驗用水，每個錐形瓶中平均分裝200 mL。將原菌懸液2 mL 接種到裝有198 mL 湖水的錐形瓶中，投菌量保持在108～109CFU/mL，同時稱取1 g 的凍干粉投入到裝有200 mL 湖水的錐形瓶中，于28 ℃條件下靜置培養7 d，測定總有機碳（TOC）的變化。

2 結果與分析

2.1 微膠囊外觀形態

微膠囊產品為淡黃色粉末，分散性、流動性較好，易溶于水。由圖1 可知，微膠囊大體呈圓球狀，囊壁較平滑，有凹陷。從破碎的微膠囊中看到內部包埋的大量細菌。造成囊壁凹陷的原因可能是由于分子之間的結合力不同，導致囊膜薄厚程度呈現差異。不同厚度的囊壁抵抗變形能力不同，從而導致在冷凍干燥過程中，薄壁處出現凹槽，從而造成微膠囊表面凹凸不平。

圖1 不同放大倍數下微膠囊掃描電子顯微鏡（SEM）觀測

2.2 微膠囊粒徑分布測定

粒徑相關分析測定結果（圖2）表明，微膠囊的比表面積（SSA）為326 cm2/g，比表面積較小，表明包埋效果較好。微膠囊的粒徑大小為2.512～954.993 μm；d（0.5）（中位徑）為134.272 μm，表明微膠囊中大于和小于134.272 μm 的顆粒各占50%；顆粒分布主要集中在104.713～239.883 μm。微膠囊粒徑分布較寬的原因可能是乳化過程中，攪拌器周邊不同空間范圍的微粒受到的作用力不同所致［10］。

圖2 微膠囊粒徑分布統計

2.3 微膠囊耐酸堿性的測定

分別在不同pH 的體系中投加菌懸液與微膠囊，保持初始含菌量相同（活菌濃度約為2.2×109CFU/g），2 h 后測定各個體系中的活菌數。由圖3 可知，在菌懸液體系中，中性條件下（pH 6～8）活菌數最高；隨著酸性或堿性的增強，活菌數均顯著下降。微膠囊的活菌數受pH 變化影響較小，活菌數始終高于菌懸液中的最高活菌數。由此可知，微膠囊化明顯增強了菌株的耐酸堿性。

2.4 微膠囊穩定性測定

將微膠囊化的菌株和未微膠囊化的菌種在恒溫57 ℃、相對濕度60%～65%條件下儲存7 d，其活菌數測定結果如圖4 所示。在恒溫57 ℃條件下儲存7 d后，未微膠囊化的活菌數降低較快，當儲存到5 d 時已基本檢測不到活菌數。微膠囊化的活菌數降低緩慢，儲存7 d 后活菌數為8.6×108CFU/g，相當于在室溫條件下儲存1 年的活菌數，僅降低了1 個數量級。可見，未微膠囊化的細菌儲存穩定性較差，不利于細菌的保存；將細菌微膠囊化，可以有效提高細菌在常溫下的存活率。

圖4 微膠囊的儲存穩定性

2.5 TOC 測定

從圖5 可以看出，菌懸液對水體的TOC 降解速度先快后慢，后期基本趨于緩和，7 d 時TOC 去除率達48.82%；微膠囊化的菌種對水體的TOC 降解速度前期比較緩和，中期比較迅速，后期仍然保持較高的去除效率，7 d 時TOC 去除率達61.21%。分析原因可能是由于微膠囊化的細菌前期處于休眠狀態，需要時間來恢復活性；待活性恢復后，逐步向水體釋放，對水體中的TOC 進行降解。由于微膠囊化后，菌株具有緩釋作用，因而能夠持續地發揮凈水作用，并且能夠耐受營養元素逐步降低的外部環境，而未微膠囊化的細菌可能隨著可利用營養物質含量的降低而整體代謝活性降低。因此，微膠囊化有利于細菌在各種復雜的條件下保持持續的高效凈水效率。

圖5 TOC 濃度隨時間的變化

3 小結

本試驗采用外源乳化法制備了貧營養復合菌微膠囊制劑。結果表明，該微生物制劑粒徑分布合理，耐酸堿性及穩定性較未膠囊化的菌株明顯提高，可在較低的濃度水平下，實現對水體TOC 的高效降解，具有良好的應用前景。