轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種子室內(nèi)篩選

張 文 劉銓義 馮 楊 逯 濤 王國平 王海娟

（新疆生產(chǎn)建設兵團第七師農(nóng)業(yè)科學研究所，奎屯 833200）

棉花是一種重要的天然植物纖維，也是重要的經(jīng)濟作物。我國是世界上生產(chǎn)、消費與進口棉花最多的國家[1]，因此棉花在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)十分重要的地位。近些年來，由于氣候條件、生態(tài)環(huán)境、耕作制度以及種植業(yè)結(jié)構(gòu)的改變，農(nóng)業(yè)害蟲抗藥性不斷增加，棉田害蟲為害特別是棉鈴蟲的為害日益嚴重，棉鈴蟲種群數(shù)量總體上呈增加趨勢[2]。化學防治是抑制棉鈴蟲為害的重要手段，雖然該種方法抑制效果好，但會對環(huán)境造成嚴重污染，更關鍵的是長期使用化學殺蟲劑極易使棉鈴蟲產(chǎn)生抗藥性，導致實際生產(chǎn)中化學防治效果甚微[3-4]。隨著科技的不斷發(fā)展，我國開始推廣種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，由于其能很好地控制棉鈴蟲的發(fā)生，種植區(qū)域不斷擴大，到2017 年全國轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的種植面積約280 萬hm2[5]。

轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是推動我國棉花產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的重要舉措，建立一種簡單、方便、快速的轉(zhuǎn)基因棉花檢測與鑒定方法是促進其發(fā)展的關鍵[6]。卡那霉素抗性基因是目前植物遺傳轉(zhuǎn)化中應用最早和最廣泛的一種選擇標記基因，通過阻斷非轉(zhuǎn)化植株葉綠體蛋白質(zhì)的合成，促使植株白化來達到鑒定與篩選的目的。李雪林等[7]發(fā)現(xiàn)利用卡那霉素溶液浸種萌發(fā)法可更加簡便、大量、快速地鑒定與篩選出轉(zhuǎn)基因棉花植株。趙俊俠等[8]研究發(fā)現(xiàn)將棉種浸泡于150mg/L 卡那霉素中，2～4d 后根據(jù)種子萌發(fā)長度可進行轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的篩選。呂孟雨等[9]研究認為采用卡那霉素溶液浸種是一種經(jīng)濟有效且準確可行的篩選含有npt-II 基因的轉(zhuǎn)基因棉花材料的方法。也有學者研究發(fā)現(xiàn)，田間卡那霉素篩選是一種快捷的棉花轉(zhuǎn)基因鑒定與篩選方法，但可靠性低，準確率只有20%[10]。此外，田間一株一葉涂抹不僅工作量繁重，也極易受天氣環(huán)境和人為操作的影響，從而造成鑒定結(jié)果假陽性偏多[11]。PCR 技術也是最主要的轉(zhuǎn)基因檢測技術之一[12]，但PCR 法較復雜，不但需要昂貴的儀器設備和專業(yè)的技術人員，且耗時較久，抽樣量、抽樣面積小也易導致漏檢，不適合大規(guī)模篩查和現(xiàn)場即時檢測。隨著科學技術的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因試紙條技術應運而生。寧新民等[13]提出，試紙條檢測法是一種十分有效的外源抗蟲基因檢測手段。張欣等[14]采用轉(zhuǎn)基因試紙條法與熒光定量PCR 法對大批量稻谷和大米樣品進行檢測，2 種方法檢測結(jié)果基本一致。Mutoni 等[15]用試紙條法和PCR 法檢測了115 份玉米樣品，結(jié)果顯示PCR 法與蛋白質(zhì)試紙條法的檢測結(jié)果完全一致。因此，本研究通過轉(zhuǎn)基因試紙條法和卡那霉素室內(nèi)浸種法，摸索出一種簡單、方便、快速、準確的鑒定轉(zhuǎn)基因棉花的方法來滿足轉(zhuǎn)基因種子的鑒定與篩選需要。

1 材料與方法

1.1 供試材料轉(zhuǎn)基因抗蟲棉材料為魯棉研24 號母本和魯棉研24 號父本，由北京中農(nóng)金科種業(yè)科技有限公司提供；非轉(zhuǎn)基因材料為國審棉Z1112 和新審棉Z1146，由新疆生產(chǎn)建設兵團第七師農(nóng)業(yè)科學研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因試紙條檢測法選用浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司（靈敏度1%）、上海佑隆生物科技有限公司（靈敏度1%）和奧創(chuàng)生物技術（山東）有限公司（靈敏度2ng/mL）生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因試紙條進行轉(zhuǎn)基因檢測。將20 粒種子磨碎至粉末狀后，按照說明書的步驟進行樣本處理和檢測，一般5～10min 可出結(jié)果。

陽性（有轉(zhuǎn)基因）即在檢測試條的檢測區(qū)及質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)兩條紫紅色條帶，即一條檢測線和一條質(zhì)控線。陰性（無轉(zhuǎn)基因）表現(xiàn)為僅在檢測試條的質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紫紅色質(zhì)控線。

1.2.2 卡那霉素浸種法供試藥劑為100 萬單位（1g/mL）的硫酸卡那霉素注射液，由河北遠征禾木藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。用蒸餾水將硫酸卡那霉素注射液分別配成0mg/L（蒸餾水）、2500mg/L、5000mg/L、7500mg/L 的溶液，將供試的4 種棉花種子各取60粒，3 個重復，分別浸泡在不同濃度的硫酸卡那霉素溶液中，放入28℃恒溫發(fā)芽培養(yǎng)箱中浸種48h，然后進行瀝干催芽8h，觀察棉種發(fā)芽情況。將種子按照常規(guī)沙培發(fā)芽試驗的方法播種，放入28℃恒溫發(fā)芽培養(yǎng)箱中，于播種后10d 觀察側(cè)根生長情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析采用WPS office 軟件進行數(shù)據(jù)處理和制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因試紙條檢測選用非轉(zhuǎn)基因材料Z1112、Z1146 和轉(zhuǎn)基因抗蟲棉魯棉研24 號父本、魯棉研24 號母本為材料，用3 個品牌的Bt-CryI Ab/Ac 試紙條對其進行檢測，結(jié)果（圖1）顯示3 個品牌的試紙條檢測結(jié)果完全一致，均能快速、準確地檢測出非轉(zhuǎn)基因材料和轉(zhuǎn)基因抗蟲棉材料，且準確率達到100%，說明轉(zhuǎn)基因試紙條法是一種簡單、快捷、準確的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉篩選方法。

圖1 3 種轉(zhuǎn)基因試紙條對不同棉花品種的檢測結(jié)果

2.2 硫酸卡那霉素溶液浸種后的發(fā)芽情況由表1 可知，以不同濃度硫酸卡那霉素溶液處理的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉種子（魯棉研24 號父本和魯棉研24 號母本）浸泡后發(fā)芽率均在90%（含）以上，而非轉(zhuǎn)基因材料的種子（Z1112 和Z1146）發(fā)芽率隨著硫酸卡那霉素溶液濃度的增大而大幅度降低，當硫酸卡那霉素溶液濃度在5000mg/L 時，發(fā)芽率分別為31.7%、53.3%，濃度升至7500mg/L 時，發(fā)芽率分別僅為16.7%、31.7%。

表1 硫酸卡那霉素對棉花種子發(fā)芽情況的影響

2.3 硫酸卡那霉素溶液浸種后側(cè)根生長情況由圖2 可知，培養(yǎng)10d 后，不同濃度硫酸卡那霉素溶液處理的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉均有幼苗長出側(cè)根，硫酸卡那霉素溶液濃度在5000mg/L 時，魯棉研24 號父本和魯棉研24 號母本分別有79.2%、72.4%的棉種有側(cè)根長出，當硫酸卡那霉素溶液濃度達到7500mg/L時，僅有27.9%、46.0%的棉種有側(cè)根長出。而非轉(zhuǎn)基因材料隨著硫酸卡那霉素溶液濃度的增加側(cè)根長出比率急劇下降，當硫酸卡那霉素溶液濃度在5000mg/L 時，Z1112 和Z1146 僅有5.6%、9.7%的棉種有側(cè)根長出，至7500mg/L 時，2份材料均無側(cè)根長出。因此，用5000mg/L 的硫酸卡那霉素溶液浸種48h，并持續(xù)培養(yǎng)10d，可根據(jù)側(cè)根發(fā)生情況有效篩選出轉(zhuǎn)基因棉花。

圖2 硫酸卡那霉素溶液處理對棉花側(cè)根長出比率的影響

3 結(jié)論與討論

對后代進行篩選和鑒定是轉(zhuǎn)基因抗蟲棉育種的首要工作，因此，建立一種快速、準確、成本低廉的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉篩查方法十分必要。目前，關于轉(zhuǎn)基因棉花的篩選已有許多報道，大多都是在田間利用卡那霉素溶液對葉片進行涂抹，這種方法不僅工作量大，而且受季節(jié)的局限[16]。針對上述情況，有學者開始在室內(nèi)利用卡那霉素進行轉(zhuǎn)基因植株的后代篩選，李雪林等[7]研究發(fā)現(xiàn)100mg/L 卡那霉素溶液能顯著抑制非轉(zhuǎn)基因棉種的萌發(fā)和下胚軸的伸長；經(jīng)PCR 驗證，篩選出的棉種陽性率達到95%以上。王彥霞等[16]提出了3 種可在室內(nèi)快速篩選與鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的方法，但都是基于葉片對卡那霉素溶液產(chǎn)生的黃化反應，而且試驗的工作量也比較大。寇偉等[17]研究發(fā)現(xiàn)5000mg/L 卡那霉素溶液浸種后通過觀察棉種的側(cè)根生長情況可較為準確、快速地篩選出轉(zhuǎn)基因棉花。孫鋒等[6]研究認為將棉種浸泡在濃度為4000mg/kg 的卡那霉素溶液中48h 可快速篩選出轉(zhuǎn)基因種子。本研究結(jié)果與上述結(jié)果基本類似，用5000mg/L 的硫酸卡那霉素溶液浸種48h，并持續(xù)培養(yǎng)10d，可有效篩選出轉(zhuǎn)基因棉花。但也有學者認為利用卡那霉素浸種法篩選轉(zhuǎn)基因種子受諸多因素影響，如:培養(yǎng)基質(zhì)、藥劑處理方式、卡那霉素濃度、溶液體積、種子數(shù)甚至籽粒的飽滿程度、浸種時間、遺傳背景等都會對篩選效果有很大影響[18]。

本研究還進行了轉(zhuǎn)基因試紙條檢測，結(jié)果顯示3 個品牌的試紙條檢測結(jié)果完全一致，均能快速、準確地檢測出轉(zhuǎn)基因抗蟲棉材料，整個檢測過程只需要10～15min，且不需要專業(yè)的技術人員，對實驗的條件要求也不嚴格，而相對來說，卡那霉素浸種法的檢測周期更長，而且存在試驗誤差，影響試驗準確率。因此，轉(zhuǎn)基因試紙條法是一種更為快速、準確的鑒定和篩選轉(zhuǎn)基因抗蟲棉植株的方法。隨著轉(zhuǎn)基因試紙條技術的不斷成熟和發(fā)展，其有望在我國轉(zhuǎn)基因植株篩選和鑒定方面發(fā)揮更大的作用。