STE20L4促進擬南芥下胚軸伸長的機制研究

佘玉婷　丁勇

摘? 要：下胚軸伸長是高等植物進行正常生命活動的保障，下胚軸的伸長協助植株破土而出并由異養轉變為自養生長。本研究通過對一系列擬南芥突變體材料進行下胚軸觀察，鑒定到一個具有短下胚軸的突變體，并對其調控下胚軸伸長的分子機制進行初步探索。結果表明：編碼與酵母中同源的絲裂原活化蛋白激酶，在MAPK級聯信號通路中作為MAP4K激活下游的MAP3K。基因型鑒定和半定量結果顯示，、均為功能缺失的突變體。通過表型觀察，突變體無論在長日照（16 h光照/8 h黑暗）、短日照（8 h光照/16 h黑暗）及黑暗（24?h黑暗）條件下與野生型相比均呈現出短的下胚軸。細胞學結果顯示，突變體短的下胚軸是由于其細胞長度的變短而不是細胞數目的變化導致的。植物激素赤霉素可促進下胚軸的伸長，對其處理的敏感性可作為是否參與GA信號轉導途徑的判斷方法。在不同梯度濃度的GA處理（0、0.5、1、2、5 μmol/L）下，突變體與野生型相比下胚軸伸長作用不明顯。多效唑（PAC）是內源GA合成的抑制劑，隨著不同梯度濃度的PAC處理（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μmol/L），突變體下胚軸伸長的抑制作用相對于野生型不明顯。上述生理學結果表明，參與到GA信號轉導通路中調控擬南芥下胚軸的生長發育。將STE20L4蛋白與熒光標簽融合后轉染煙草或擬南芥原生質體觀察其亞細胞定位，結果表明STE20L4在細胞膜和細胞質中均有表達。對野生型、突變體中進行一系列GA下游與下胚軸伸長相關基因的RT-qPCR檢測，結果表明、、、、和基因的轉錄水平在突變體中明顯下調，即可能通過間接調控這些下游基因的表達參與下胚軸的伸長。綜上，參與GA信號轉導通路，且通過促進GA下游下胚軸伸長相關基因的表達調控下胚軸的伸長。本研究初步闡述了調控植物下胚軸伸長的分子機制，為進一步研究MAPK與GA互作調控植物生長發育提供參考。

關鍵詞：;下胚軸;GA;PAC;細胞長度中圖分類號：S565.9 ?????文獻標識碼：A

Mechanism Study ofin Promoting Hypocotyl Elongation of

SHE Yuting DING Yong

School of Life Sciences， University of Science and Technology of China， Hefei， Anhui 230027， China

Hypocotyl elongation assists plants to break through the soil and changes from heterotrophic to self-sustaining， which is the guarantee of normal life activities of higher plants. In this study， a mutant with shorter hypocotyl was identified by observing the hypocotyl of a series of mutants in our laboratory and the molecular mechanism of regulating hypocotyl elongation was preliminarily explored. ， as a MAP4K， encodes a mitosis-activated protein kinase homologous to in yeast and activates downstream MAP3K in the MAPK cascade signaling pathway. Genotyping identification and semi-quantitative results showed that and were mutants with loss of function. Through phenotype observation， the mutant shows a short hypocotyl either in long daylight （16?h light/8?h dark）， short daylight （8?h light/16?h dark） and dark （24?h dark） conditions compared with the wild type. Cytological results showed that short hypocotyl of mutants were due to a shortening of cell length rather than a change in cell number. The plant hormone gibberellin can promote the elongation of the hypocotyl and the sensitivity to its treatment can be used as a method of judging whether to participate in the GA signal transduction pathway. Under different gradient concentrations GA （0， 0.5?μmol/L， 1?μmol/L， 2?μmol/L and 5?μmol/L） treatment， the hypocotyl elongation of mutants were not significant compared with the wild type. Paclobutrazol （PAC） is an inhibitor of endogenous GA synthesis， with gradient concentrations PAC （0， 0.01 μmol/L， 0.02 μmol/L， 0.05 μmol/L， 0.1 μmol/L， 0.2 μmol/L， and 0.5 μmol/L） processing ， the inhibition of hypocotyl elongation in mutants were also less pronounced than wild type. The above physiological results show that is involved in regulating the growth and development of hypocotyl in the GA signal transduction pathway. After fusing the protein of STE20L4 with fluorescent tags， we transfected them into tobacco and protoplasts to observe subcellular localization， the results showed that STE20L4 was expressed in both cell membranes and cytoplasm. A series of RT-qPCR of GA downstream genes associated with hypocotyl elongation were tested in the wild-type and mutants. The results showed that the transcriptional levels of ， ， ， ， and genes were significantly downregulated in the mutant， suggesting may participate in hypocotyl elongation by indirectly regulating the expression of these downstream genes. In summary， participates in the GA signal transduction pathway and regulates hypocotyl elongation by promoting the expression of hypocotyl elongation-related genes downstream of the GA. Our study preliminarily elaborated the molecular mechanism of regulating plant hypocotyl elongation， which provides a reference for further study of the interaction between MAPK and GA to regulate plant growth and development.

; hypocotyl; GA; PAC; cell length

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.06.006

植物的整個生活史包括胚胎形成、種子萌發、下胚軸伸長，營養生長、生殖生長、果實成熟及衰老等過程。下胚軸是連接子葉和根的胚性部分，保證水分、無機鹽、營養物質和激素等物質的順利運輸。下胚軸伸長是長期自然選擇的結果，其伸長協助了幼苗出土這一過程，同時也是植物進行光合作用、實現自養的必要前提，但下胚軸過度伸長容易造成幼苗徒長，抗逆性能力差，不利于產量提高和品質改良。因此，合適的下胚軸伸長是植物進行正常生命活動的保障。

下胚軸的伸長受環境因子和多種內源激素的綜合調控。其中，光強與光質調控下胚軸細胞伸長的機制類似，主要是通過光受體PHYA、PHYB、CRY1和CRY2調控PIFs，進而影響下游基因的表達，從而實現對下胚軸伸長的調控。溫度調控機制也主要依賴于PHYB，高溫促使細胞核中的PHYB由Pfr（生理活躍型）向Pr（生理失活型）轉變，并向細胞質中遷移，從而解除其對PIFs及COP1-SPA的抑制作用，誘導下胚軸細胞伸長。植物激素如赤霉素、生長素、獨腳金內酯等均參與調控下胚軸伸長的過程。赤霉素（GA）主要通過調控DELLA蛋白含量影響下胚軸細胞的伸長。生長素（IAA）通過與TIR1結合，進而促進AUX/IAAs蛋白結合到SCF-Auxin復合體中泛素化降解，解除其對ARF的轉錄抑制作用從而影響下胚軸細胞的伸長。獨腳金內酯（SLs）通過信號轉導蛋白MAX2促使光信號轉導關鍵因子表達上調，HY5蛋白積累能促使植物光形態建成，抑制下胚軸伸長。

自20世紀60年代起，“綠色革命”中半矮化育種的大規模推廣大幅度地提高了世界主要糧食作物的產量。水稻和小麥的“綠色革命”均與赤霉素密切相關。赤霉素是一類雙萜類化合物的植物激素，在植物整個生命周期中均起著重要作用，在種子萌發、葉片伸展、莖和根的伸長、花和果實的發育等方面均起到了重要的調控作用。GA主要通過細胞伸長的方式促進下胚軸的生長。DELLA蛋白是GA信號轉導的關鍵作用元件，能與一類bHLH類轉錄因子結合，導致其轉錄激活作用受到阻遏，從而抑制光形態建成。植株在缺失GA的情況下，DELLA蛋白會累積到較高水平，抑制轉錄因子活性，從而抑制GA調節的下游基因表達;在受到GA誘導的情況下，GA與受體GID1結合，促進GID1與DELLA蛋白結合，導致DELLA蛋白與SCF復合體相互作用繼而被泛素化，最終通過26S蛋白酶體途徑降解，解除其對下游轉錄因子活性的抑制作用。

MAPK通路在動物中已經被研究證明是多種信號通路的中心，可用來接收胞外的信號并將其傳遞給胞內，并最終被帶入細胞核中。經典的MAPK信號通路通過MAP3K、MAP2K、MAPK的級聯磷酸化的過程逐級激活和傳遞信號。MPK3/MPK6是擬南芥MAPK核心成員，在調控植物生長發育及對生物和非生物脅迫的響應中發揮著重要作用。然而關于MAPK信號更為上游的MAP4K家族的研究報道很少，擬南芥中共有10個MAP4Ks，其功能直到2013年才有研究報道。本研究選取表型較為明顯的MAP4K4作為研究對象，作為酵母中的的同源基因，已有研究表明STE20可將酵母的組蛋白H2BS10磷酸化，最終影響酵母的細胞周期。為了研究方便，將其命名為STE20-Like-4（）。近年來，有研究表明能夠參與免疫調節，通過磷酸化PP2C38從而激活BIK1，協同SIK1共同調節flg22誘導的免疫應答。另一研究表明，通過參與到油菜素內酯信號途徑調控擬南芥熱形態建成。因此，本研究將進一步探索是否可以整合其他植物激素調節植物的生長發育過程。

本研究發現功能缺失的突變體表現出短的下胚軸，對GA和PAC的處理不敏感，表明其參與GA的信號轉導過程。STE20L4定位于細胞質和細胞膜，并通過下游細胞伸長相關基因調節細胞伸長和下胚軸的伸長。綜合運用遺傳分子細胞等手段闡述了和赤霉素信號協同參與細胞伸長過程，豐富了植物生長發育調控網絡。

材料與方法

? 材料

（Salk_086087）和（Salk_ 065417）突變體訂購于美國ABRC（Biological Resource Center）突變體庫，擬南芥（L）于22℃中，光周期為16 h光照/8 h黑暗的溫室培養。

方法

1.2.1? 下胚軸長度測量? 將供試材料種子無菌處理后均勻地點在1/2?MS培養基上，4℃吸水2～3?d，按照所需要的擬南芥生長環境培養一周左右（注意光照不宜過強），用鑷子將下胚軸按倒在培養皿上，用萊卡m165c體視鏡測量每一個下胚軸的長度，萊卡體視鏡配套軟件中直接有距離尺軟件，統計下胚軸長度。

1.2.2? GA與PAC敏感性處理? 在1/2 MS培養基上設置不同的GA濃度梯度（0、0.5、1、2、5?μmol/L）與PAC濃度梯度（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5?μmol/L），將所需要處理的突變體和對照組均勻地點在培養基上，4℃吸水2～3?d，按照所需要的擬南芥生長環境培養一周左右（注意光照不宜過強），再用萊卡m165c體視鏡統計下胚軸長度。

1.2.3? 蛋白定位? 原生質體：將STE20L4蛋白的CDS序列構建到PUC19-eGFP載體中，提取較高純度的質粒。將質粒轉入擬南芥原生質體中，黑暗培養10～12 h，在共聚焦顯微鏡（ZEISS Xradia 880）下觀察定位。

煙草：將STE20L4蛋白的CDS構建至1300-eGFP載體上，瞬轉煙草常溫避光保溫36～ 48?h。撕取注射菌液的煙草下表皮細胞于激光共聚焦顯微鏡下觀察相應熒光的定位。

1.2.4? 基因型鑒定? 根據T-DNA插入選用的不同載體設計中間引物（SALK系列中間引物BP為LBb1.3），然后通過T-DNA Primer Design網站查詢插入位點的上游引物LP和下游引物RP（表1）。以提取的基因組作為模板，使用上游引物、中間引物和下游引物進行PCR鑒定。

野生型（未插入）只能得到1條約1100 bp的條帶，純合突變體也只能得到1條約500～ 800?bp的條帶。PCR反應體系：總體系為20?μL，其中模板1?μL，10×Easytaq buffer 2 μL，Easytaq酶0.2 μL，上下游引物各0.4 μL，10?mmol/L dNTPs 0.4 μL，ddHO 15.6?μL。擴增程序：94℃預變性3 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1～2 kb/min，共34個循環;最后72℃充分延伸8?min。

1.2.5? RNA提取、半定量及Q-PCR分析? RNA提取：取生長一周左右的野生型和突變體材料約0.1?g，采用Trizol（TransGen Bio-tech）試劑提取植物葉片總RNA，并反轉錄為cDNA。

半定量檢測：參照PCR程序分別擴增內參基因（TUBLIN）和待檢測靶基因，不斷調整模板的比例，使得內參基因PCR產物亮度基本一致，再以等比例的DNA模板，選取適當的PCR擴增圈數比較野生型與突變體靶基因擴增的亮度。

Q-PCR分析：采用SYBR superMix試劑盒（TransGen Bio-tech），在定量PCR儀（Bio-Rad）上擴增，以UBQ10為內參，并通過2法計算相對表達量。Q-PCR反應體系：總體系為20?μL，其中cDNA 3?μL，2×Q-PCR mix 10 μL，上下游引物各0.2?μL，ddHO 6.6?μL。擴增程序：95℃預

變性3 min;95℃變性10 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環;融解曲線：95℃（預變性）10 s，65℃（退火溫度）5 s，下個循環預變性溫度不變，退火溫度依次+1℃，共31個循環，反應終止。

結果與分析

2.1? 突變體獲得及表型觀察

為了研究STE20L4蛋白的功能，本研究獲得2個T-DNA插入的突變體和，基因的結構示意圖見圖1A，突變體插入在基因第2位外顯子上，突變體插入在基因第8位外顯子上。基因型分析結果可看出，和均是T-DNA插入的純合突變體（圖1B）。半定量檢測轉錄水平結果也顯示，和均為功能缺失突變體（圖1C）。在長日照（16?h光照，8?h黑暗）下通過表型觀察，突變體與野生型相比開花上沒有明顯表型，但整體植株較小（圖1D～圖1E）。將Col-0、和在1/2 MS固體培養基上培養7?d，觀察下胚軸表型，統計樣本超過40株。由圖2可知，在短日照、長日照及黑暗條件下，突變體均明顯表現出短下胚軸表型，這表明可能參與到赤霉素調控途徑中。

2.2? 參與信號轉導通路

本研究檢測了野生型和突變體的下胚軸細胞長度和細胞數目。Col-0、和下胚軸在長日照條件下生長7?d后，用PI（碘化丙啶）染色，激光共聚焦顯微鏡掃描細胞長度。結果表明，與野生型下胚軸細胞相比，突變體的下胚軸長度明顯變短，而統計的下胚軸細胞個數無明顯差異（圖3A～圖3C），說明突變體的短下胚軸表型是由細胞長度變短導致。赤霉素可促進植物下胚軸的伸長，用梯度濃度的GA（0、0.5、1、2、5?μmol/L）處理野生型、突變體和三突變體（三突為GA/PAC不敏感的正對照），以Col-0對GA的敏感程度當作100%，各突變體對GA的敏感程度均相較于野生型不明顯。由圖4A～圖4B可知，隨著GA濃度的升高，野生型的下胚軸長度明顯伸長，而、與的下胚軸長度增長幅度明顯變小，表現出對外源GA處理不敏感的表型。為進一步驗證此結論，本研究使用不同濃度的內源GA合成抑制劑PAC（0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μmol/L）處理Col-0、、和。同樣，以Col-0對PAC的敏感程度當作100%，各突變體對PAC的敏感程度均相較于野生型不明顯。由圖4C～圖4D結果顯示，野生型下胚軸隨著PAC濃度升高明顯變短，而、與的下胚軸變短的幅度小。由此確定參與到GA信號轉導通路中，并調控擬南芥下胚軸的生長發育。

的定位觀察

本研究將STE20L4與GFP標簽融合，瞬時轉染煙草。綠色熒光信號顯示，STE20L4蛋白主要定位在細胞膜和細胞質中（圖5A）。同時，將STE20L4與GFP和tagRFP標簽融合，分別轉染擬南芥原生質體。熒光觀察發現，無論是融合綠色的熒光標簽還是紅色熒光標簽，STE20L4蛋白均定位于細胞膜上（圖5B），這與JIANG等的研究結果一致。這表明正常情況下STE20L4不在細胞核內發揮功能。

2.4? 促進下胚軸伸長相關基因的表達

本研究檢測了很多與細胞伸長相關的下游基因，看其是否受STE20L4的調控。取生長約一周大小的野生型和突變體材料，提取RNA并反轉錄為cDNA，利用RT-QPCR檢測GA下游基因的表達，結果顯示很多基因如、、、、、在突變體中下調表達（圖6）。這一結果與相應的下胚軸表型一致，表明可有效激活細胞伸長相關基因的表達，并參與到GA信號通路中促進下胚軸的伸長。

?討論

研究植物下胚軸伸長的調控機制，有助于深入了解植物生長發育規律和提高農業產益。MAP激酶途徑介導對各種刺激的反應，包括有絲分裂原和不同類型的應激。雖然我們對植物MAP4Ks的了解在逐漸增加，但對它們的功能及其調控機制仍鮮有報道。JIANG等曾報道（）參與植物的免疫調節應答從而抵抗病原菌的侵染。最近的報道還發現在溫暖溫度下影響油菜素內酯（BR）介導的下胚軸伸長。本研究則顯示突變體在擬南芥正常生長溫度（22℃）下也表現為較短的下胚軸表型，并且這一表型不受光周期途徑的變化而變化，同時發現可參與到GA信號轉導通路中調控擬南芥下胚軸細胞的伸長過程。DELLA蛋白可整合多種植物激素來調控PIFs從而調控下胚軸的伸長，那么既參與BR信號通路又參與到GA信號通路中，是否介導多種植物激素之間的crosstalk從而調控植物的生長發育過程，還需要更多強有力的實驗來證實。經典的GA信號轉導通路是通過調控核定位蛋白DELLA的降解從而調控植物的生長，而STE20L4主要定位于細胞膜中，是否存在某種信號或與某個蛋白的相互作用，使其定位發生動態變化進而與DELLA蛋白產生關聯，還需進一步的探究。此外，雖然參與GA信號轉導通路且突變體中下胚軸伸長相關基因下調，但并不能說明僅通過GA依賴的方式調控下胚軸的伸長，不排除直接調控下游基因的可能性，下一步將從遺傳學上判斷其上下游關系，而這些基因的啟動子是否可被直接靶向結合等更為精細的分子機制還有待進一步的研究。

目前盡管已在植物激素調節擬南芥生長發育過程方面取得了巨大進展，但關于植物激素如何協同蛋白激酶共同調控單子葉植物下胚軸伸長的模式研究仍處于起步階段。因此，有必要進行更深入的研究來揭示和闡明絲裂原活化蛋白激酶與不同植物激素的局部合成、感知、轉運及其串擾對擬南芥生長發育的調控作用。而擬南芥中已取得的成果可作為今后研究的鋪墊，有助于增強作物的適應性反應及提高作物產量。

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