基于核磁共振技術的合歡種子吸水特性

杜恬恬 代 松 錢 滕 朱銘瑋 陳 麗張中會 李淑嫻

(1.南京林業大學南方現代林業協同創新中心 南京 210037； 2.銅仁科學院 銅仁 554300；3.安徽林業職業技術學院 合肥 230031； 4.蘇州泰紐測試服務有限公司 蘇州 215163)

核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)是指具有固定磁矩的原子核在恒定磁場與交變磁場作用下，與交變磁場發生能量交換的現象(Chenetal., 2020)。近年來，核磁共振波譜(nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR)和核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技術作為核磁共振的兩個分支，憑借著其快速、準確、無損的特點，在醫學、化學、生物學等領域得到廣泛應用(Scheenenetal.，2000； K?ckenberger， 2001； K?ckenbergeretal.， 2004； 王振華等， 2014)。NMR技術主要是通過測得樣品中氫質子密度與分布，得到T1、T2值(T2橫向弛豫時間，T2的長短可以反應樣品內部水分自由度的大小即水分的相態)，用其反映樣品中水分的相態分布及含量(Takeuchietal.， 1997)，如水稻(Oryzasativa)浸種過程中水分相態及含量的變化(宋平等， 2015)、歐洲油菜(Brassicanapus)種子萌發過程中水分相態的變化(Lechowskaetal.，2019)。隨著核磁共振技術的發展，MRI成像技術能確定種子的初始吸水位點，并能判斷水分在種子內部的遷移規律，在種子吸水研究中的應用越來越普遍(Volkovetal.， 2019)。煙草(Nicotianatabacum)種子吸水在萌發的第二和第三階段吸水是不均勻的(Manzetal.,2005)； 如利用MRI技術確定大豆(Glycinemax)種子的吸水的主要吸水位點(Koizumietal.， 2008)； 明確向日葵(HelianthusAnnus)種子在吸水不同階段的水分分布規律(Rani,2014)。

合歡(Albiziajulibrissin)是含羞草亞科(Mimosaceae)合歡屬落葉喬木，適應性強，生長速度快，其樹冠開展，樹姿優美，盛夏絨花滿樹，廣泛用作庭院樹、行道樹。合歡主要用種子繁殖，但該種子硬實，種皮表面的蠟質嚴重影響了吸水作用，導致出苗不整齊，最終阻礙育苗順利進行(韓多紅等， 2016)。吸水是種子萌發的先決條件，研究種子吸水過程的傳統方法是采用染色法(Huetal.， 2008)或吸水曲線法(周健， 2015)，前者需將種子切開根據顏色變化推斷種子吸水情況，屬于破壞性測定； 后者只能定量分析種子各部位吸水量隨時間的變化(霍仕平等， 2004)，無法判斷不同種子部位的水分分布差異及動態遷移過程。鑒于此，本研究應用低場核磁共振及其成像技術，探究合歡種子初始吸水位點和吸水后種子內的水分遷移規律，測定不同吸水時間合歡種子的T2值，判斷吸水過程中的水分相態變化，旨在為深入了解合歡種子生物學及吸水特性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

2018年11月于江蘇宿遷采集合歡種子，剔除蟲害粒、種皮受損粒，再水選去除空粒，剩余飽滿種子在室內自然陰干后保存在4 ℃冰箱中待用，于2018年12月開始相關試驗。試驗用種子的千粒質量為(36.06±1.31)g； 含水量為11.4%±0.2%； 生活力為95.02%。

1.2 種子吸水率的測定

隨機取合歡種子30粒，3個重復，用千分之一天平稱自然陰干種子初始質量(m1，g)。按陳麗等(2019)的方法，用初始溫度80 ℃的熱水浸種5 min后，將種子置于裝有清水的燒杯中使其吸水。分別于吸水后2、4、6、8、10、12、24 h后取出種子，用吸水紙擦拭種子表面水分后稱取浸種后質量(m2，g)； 之后將種子重新置于裝有清水的燒杯中，重復上述操作，直至種子達到吸水平衡。對照種子未進行熱水處理，直接浸種，時間相同。按下式計算種子的吸水率，繪制吸水曲線。

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1.3 MRI技術確定種子吸水位點及吸水后的水分遷移路徑

隨機選取3顆不同吸水時間后的種子，對吸水過程進行MRI成像觀察。將裝有種子的玻璃試管置于梯度磁場中按受射頻脈沖的激發，產生磁共振，通過對梯度磁場進行相位和頻率的編碼，經過計算機處理獲得其橫切面的二維層面圖像。核磁共振掃描儀(Verios 7 T，德國Siemens 公司)主頻率為300.337 MHz，主要參數為： 視野FOVRead=FOVPhase=2.8 cm； 重復時間TR=2 000 ms； 回波時間TE=13 ms，以FID格式保存成像結果。

1.4 T2弛豫總信號幅值與種子水分質量的關系

采用硬脈沖回波序列(carr-purcell-meiboom-gill, CPMG)測定吸水過程中的種子，用SIRT(聯合迭代重建技術)算法反演操作，得到T2弛豫圖譜及峰面積，峰面積反映了種子內的含水量(彭宇飛， 2018)。隨機取出一定數量的種子(>300粒)，按前面所述方法進行浸種和吸水不同時間后，取出30粒種子，每10粒為1個重復，擦干表面水分，裝入玻璃試管中，放置在低場核磁共振儀中檢測。再將種子拿出后稱重，之后放入103 ℃烘箱中干燥至恒質量，從而得到種子的水分質量。通過回歸分析，確定T2弛豫譜總峰面積與種子水分質量的回歸方程，并通過R2檢驗回歸方程的擬合效果。

1.5 NMR技術測定種子吸水過程中各相態水分含量的變化

參照1.4 中的方法得到T2弛豫圖譜，具體為： 用初始溫度80 ℃的熱水浸種5 min后，將種子置于裝有清水的燒杯中，分別于吸水0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h后取出種子，擦干表面水分，在低場核磁共振儀中檢測，每個重復取10粒種子，重復采樣3次。測定后立刻將種子放入清水中繼續浸種。CPMG脈沖序列的主要參數： 主頻SF=23 MHz，偏移頻率Ο1=347 207 Hz，90°脈沖射頻脈寬P1=8 us，180°脈沖射頻脈寬P2=15.52 us，信號采樣點數TD=320 008，重復采樣等待時間TW=3 000 ms，重復采樣次數NS=16，回波時間TE=0.2 ms，回波個數NECH=8 000。

1.6 數據分析

利用Excel對整理采集的數據，用SPSS 22.0對測定指標進行方差分析、相關性分析； 采用OriginPro 8.5和Photoshop CS6軟件作圖和處理。

圖1 合歡種子的吸水曲線Fig. 1 Absorption curves of A. julibrissin seeds during imbibition數值為(M±SE)，下同。Each value is the mean ± standard error (SE) of three replicates. The same below.

2 結果與分析

2.1 合歡種子的吸水曲線

由圖1可知，熱水處理后的合歡種子吸水過程呈“S”型，在0～4 h，吸水率僅緩慢增加至17.30%。之后進入快速吸水階段(4～12 h)，其中在8 h后快速增至94.10%。之后進入緩慢吸水階段，在24 h后緩慢增至106.40%，并逐漸趨于平衡。在24～48 h內，吸水極為緩慢，在48 h時增至107.29%，僅增加了0.89%。基于這個吸水過程，可確定后續試驗選取的時間點。

2.2 種子吸水過程中核磁成像結果分析

合歡種子吸水過程中縱截面(冠狀面)的核磁共振成像見圖2。核磁共振成像得到的種子內部質子密度加權圖像可較好反映樣品中H質子的分布。通常H質子越密集的區域，加權圖像越明亮(圖中顯示白色)。在種子吸水過程中，其內部的H質子主要來源于水分子，因此加權圖像明亮的區域表明含水量較高即吸水較多，通過觀測圖像的灰度可判斷吸水過程中水分在種子體內的移動規律。

合歡種子吸水過程核磁共振成像見圖2。干種子的顏色較暗(圖2A)，含水量很低。吸水2 h時，種子上半部分明顯脹大(圖2B)，說明此部位已開始吸水。從MRI圖片的冠狀面還可知，種孔處有個小亮點，胚根尖端及其周圍小部分子葉區域也開始變亮。結合種子的結構(陳麗等， 2019)可發現，從種孔處吸收的水分，一部分沿著種皮右側的維管束向合點端移動； 另一部分到達胚根尖端的水分，沿著種皮與子葉的縫隙向合點端移動的同時，還向子葉中擴散，故胚根尖端及其周圍的子葉變得較亮，且右側子葉變亮區域更大，致使右側種皮的吸脹面積明顯大于左側； 此時胚軸還是比較暗，沒有水分進入。吸水4 h時，胚根尖端更加明亮，且絕大部分胚軸也開始變亮(圖2C)，說明到達胚根尖端的水分又多了一條移動路徑(即進入到胚軸中)； 此時左側種皮中間也出現一條明亮的窄長區域。這些明亮區域的變化，清晰地說明了從種孔進入種子內水分的移動規律。吸水8 h時，種子內部的水分持續增加，吸脹部位已超過二分之一，已吸脹部位的子葉與種皮的邊界更加明顯(圖2E)。左側種皮的吸水通道更加清晰可見，水分在左側子葉加速移動致使兩側子葉的吸水面積差異不大。胚根明顯脹大，胚軸的輪廓更加清晰，進入胚軸的水分繼續向子葉的中心移動，此時中間部分的子葉也開始變亮，但水分移動距離明顯短于兩側的子葉。吸水12 h時，整粒種子已充分脹大，胚的各部位都較之前更明亮。至24 h時，子葉與種皮的界限更明顯(圖2G)。此時水分雖已充滿整粒種子，但不同部位的明亮程度即水分含量并不相同： 靠近左右兩側種皮的子葉比中間絕大部分更明亮，水分更充盈； 胚軸比絕大部分子葉明亮。

2.3 種子吸水過程中T2弛豫時間與水分相態的劃分

種子吸水過程中橫向弛豫時間T2的反演圖譜如圖3。根據核磁技術的原理，T2為橫向弛豫時間，T2的長短可以反應樣品內部水分自由度的大小即水分的相態。弛豫時間越短，水分的自由度越低，反之，弛豫時間越長，水分自由度越高(宋平等， 2018)，而峰面積的變化反映該相態水分含量的變化。

圖2 合歡種子吸水過程中的核磁共振成像圖Fig. 2 NMR images of A. julibrissin seed after soaking in the coronal plane

圖3 吸水不同時間段合歡種子的T2反演圖譜Fig. 3 Spectrum inversion of transverse relaxation time T2 of A. julibrissin seed during imbibition

由圖3可知，不同吸水階段的合歡種子，其T2變化范圍主要在0.1～1 000 ms，在該范圍內出現了3個有規律的峰和1個無規律的峰，從左往右各峰值所在區間對應的T2弛豫時間分別為T2a、T2b、T2c、T2d，種子存在4種不同狀態的水。其中弛豫時間最短的T2a(0.1～1 ms)為種子內的結合水(bound water)，該狀態水主要是種子內部被淀粉、蛋白質等大分子包圍或在細胞內通過氫鍵吸附于大分子物質上的水，流動性差，只能緩慢運動；T2b(1～10 ms)為種子的胞內水(cytoplasmic bulk water, immobile water)，主要是被毛細管作用束縛或被淀粉等大分子顆粒表面的羥基氫質子快速交換形成的水分，其流動性雖受到一定限制，但略高于結合水； 弛豫時間較長的T2c(10～100 ms)為胞外自由水(extra-cellular free water)，生物體內或細胞內可自由流動，暫時不會被植物細胞內膠體顆粒或大分子所吸附，主要起溶劑作用；T2d(>100 ms)為剛進入種子內部的水分，流動性極強，活性極大(宋平等， 2015)。

表1 不同吸水階段合歡種子的T2反演表Tab.1 T2 inversion of A. julibrissin seeds at different imbibition stages

合歡種子吸水過程中T2橫向馳豫時間及信號幅值的變化見表1。由于T2d在吸水過程中變化不大，并且該狀態的水主要是剛進入種子內部殘留在種皮間隙的水的信號量，不屬于被種子營養組織吸附的水分，故表1、表2未計算此部分。吸脹過程中，結合水T2a峰的起始時間無顯著變化，但峰頂點時間及峰結束時間卻在不斷下降，有左移現象： 吸水24 h時，峰頂點時間明顯向左偏移； 而峰結束時間則在吸水6 h時即開始顯著左移。0 h的種子即熱水處理后的種子，胞內水含量很低，可忽略不計。隨吸水時間的延長，作為胞內水的T2b，該峰的起始時間、峰頂點時間、峰結束時間呈波動變化趨勢，但所有結果差異不顯著； 相比上述2個峰，流動性較強的T2c在各測定時間點的變化較大，吸水2 h時，峰起始時間由0 h的19.06 ms顯著下降到13.24 ms，隨后各峰起始時間點呈波動變化，但差異均不顯著； 吸水初期，峰頂點時間也呈下降趨勢，特別在0～2 h時下降的幅度更大些，由0 h的115.15 ms顯著下降到74.30 ms，2～4 h時峰頂點仍為顯著下降，隨后峰頂點時間逐漸趨于穩定； 隨吸水時間延長，峰結束時間在0～2 h首先略有下降，但差異不顯著。2～4 h時顯著上升，但在6 h時突然迅速下降，由4 h時的668.06 ms顯著下降到258.40 ms。吸水6 h后，峰結束時間呈緩慢下降的變化趨勢。因此，T2c的峰在整個吸水過程中明顯左移，說明浸種過程中胞外自由水中氫質子的自由度在降低，水分的流動性逐漸減弱。

2.4 核磁共振T2弛豫總信號幅值與種子水分質量的關系

由圖4可知，種子核磁共振弛豫圖譜峰面積(S)與水分質量(X，g)線性擬合關系：S=21 132X+695.05，R2=0.999 6，擬合較好。因此，可用峰面積反映種子內水分含量。

2.5 種子吸脹過程中各相態水分相對含量的動態變化

吸水過程中種子各峰面積比例的動態變化見表2。T2a、T2b、T2c對應的峰面積即各相態水的含量，分別用S2a、S2b、S2c表示，峰面積比例為某一狀態水的峰面積與總峰面積的比值。在吸脹過程中，合歡種子的峰面積S2a、S2b、S2c處于動態變化中。結合水S2a在前期0～4 h內呈現上升趨勢，但各峰面積差異不顯著； 6 h時峰面積突然顯著下降，由4 h時的3 022.60下降到1 537.42，下降了49.14%，隨后S2a呈波動變化； 48 h時的結合水峰面積由初始吸水階段的2 751.16降低至測定過程的最低值1 210.71，下降55.99%(P<0.05)，說明浸種過程中結合水含量在明顯減少。S2b的變化與S2a大不相同，隨浸種時間延長呈逐漸增加趨勢。在前期吸水階段峰面積快速增加，由吸水2 h時的1 502.58增加至6 h的10 879.07，增加了624.03%； 浸種6 h后，S2b上升速度變慢，但整體仍呈顯著增加趨勢； 浸種36 h時，S2b較2 h時增加了1 061.45%； 浸種48 h時，S2b略有下降，但較36 h時差異不顯著。在吸水前期(0～4 h)，胞外自由水S2c雖呈增加趨勢，但差異不顯著； 在吸水4～10 h過程中，S2c進入迅速增加階段，且相鄰兩階段之間差異顯著(P<0.05)，在10 h時的峰面積增至32 103.99，較0 h時增加了884.20%； 隨后S2c峰面積增加速度開始放緩，在48 h時增至39 948.16，較0 h時增加1 124.68%。

圖4 合歡種子核磁共振T2弛豫峰面積與水分質量之間的回歸關系Fig. 4 Relationship between NMR peak area of T2 relaxation spectrum and thewatermass of A. julibrissin seeds

吸水過程中，合歡種子各峰面積的比例即各吸水階段每一相態水的相對含量在不斷變化。結合水S2a的峰面積比例呈先快速下降(0～6 h)再逐漸緩慢下降(6～48 h)趨勢： 0 h時種子內結合水較多，占水分總量的45.13%； 6 h后迅速下降至4.80%； 48 h時僅為2.08%。浸種過程中，種子中胞內水S2b的比例呈先迅速增加后逐漸減小的變化趨勢，浸種2 h時種子內開始出現較多的胞內水，比例迅速增加到17.09%； 6 h時進一步增到33.98%； 8 h時為31.29%，較6 h時略有下降； 隨后幾個測定時間段，胞內水比例基本維持在30.00%左右。種子內胞外自由水在0 h時占53.51%，說明熱水處理后合歡種子中主要的水分為胞外自由水； 在最初吸水階段(0～4 h)胞外自由水S2c的比例變化不大，都在50.00%左右； 吸水6 h時迅速增至61.22%，10 h時達67.43%； 10 h后基本穩定在67.00%以上。總的來說，種子內部不同相態水的比例在吸水過程中呈動態變化，即種子內部不同相態的水分存在相互轉化關系，并且胞外自由水的含量遠高于其他相態的水。

表2 浸種過程中合歡種子各峰面積及其比例的變化Tab.2 The changes of peak area of A. julibrissin seeds

3 討論

3.1 種子的初始吸水位點

植物體內各部位水分(也就是說氫質子)的分布并不均勻，因此用MRI技術可得到亮度不同的圖像，進而分析植物體內水分分布情況(張新宇， 2020)。本研究用核磁共振成像技術觀察合歡種子吸水過程， 吸水2 h時種孔首先變亮，是初始吸水位點。但陳麗等(2019)采用苯胺藍染色法發現種脊是合歡種子的初始吸水位點。這可能由于合歡種子太薄，核磁共振儀無法以種脊為核心掃描其吸水情況，因此種脊和種孔在初始吸水時的作用還有待進一步研究。不同植物種子的種皮結構不同，初始吸水位點也不同(Turneretal.， 2009； Grazielaetal.， 2017)。Baskin(2003)發現豆科(Leguminosae)植物種子的吸水位點大多數是種脊，但加拿大紫荊(Cerciscanadensis)(張琪等， 2020)和薄葉臘腸樹(Cassialeptophylla)是種孔(De Paulaetal.， 2012)，象牙花(Erythrinaspeciosa)(Delgadoetal， 2015)和鳳凰木(Delonixregia)(Jaganathanetal.， 2017)為種臍。

3.2 吸水后水分在種子中的移動路徑

通過MRI圖像發現，進入種孔的水分一部分沿著種皮兩側的維管束向合點端移動； 到達胚根尖端的水分，又有如下移動路徑： 一部分沿種皮與子葉的縫隙向合點端移動，并進入子葉的外側； 還有一部分水分由胚根尖端進入胚軸中，并向子葉中移動。Kaori等(2006)發現小豆(Vignaangularis)種子吸水后水分主要通過種皮和子葉的空隙部分運輸。不同植物種子的種皮結構不同，水分移動路徑也就不同。Koizumi等(2016)發現刺槐(Robiniapseudoacacia)種子吸水中的水分通過種脊進入種子后，以兩條途徑移動，一條通過種臍緩慢遷移至胚根，另一條經過合點端后繼續沿著種臍對面的種皮到達胚軸。

在本研究中，吸水初期(0～6 h)，合歡種子右側吸脹面積較左側稍大。由合歡種子的解剖結構(陳麗等， 2019)可發現，兩側種皮中雖都存在維管束結構，但右側維管束直接連接種臍區域，而維管束又利于水分運輸(郭學民等， 2020； 張琪等， 2021)，這可能是初期右側種子吸水較快的主要原因。本研究通過MRI圖像還發現，水分在子葉外側的移動速度比中間部分快些。陳麗等(2019)采用TTC染色法也發現合歡子葉外側最先染成紅色，后向中間擴散。種子結構、營養物質的種類不同，水分移動速度也不同(Kikuchietal.， 2006； Malgorzataetal.， 2007； Koizumi， 2014)。合歡種子熱水處理后浸種24 h即可完全脹大，水分之所以能如此迅速進入種子，是因合歡種子主要由種皮和胚兩部分組成，其中子葉在整個種子中占有很大的比例，而子葉又以蛋白質為主，蛋白質表面分布著許多-COOH，-OH，-NH2等親水基團，這些基團對水有很強親和性(金銀根， 2010)。而豆科其他植物的種子，如紫荊(C.chinensis)，由于存在膠狀胚乳殘余組織，完全吸脹所需時間較長(周健， 2016)。

3.3 吸水過程中水分相態的變化

吸水是水分子與種子內大分子物質結合的過程。植物體內氫質子的狀態反映了水分的分布與束縛程度(賈超， 2018)。根據T2變化范圍，可將合歡種子中的水區分為胞外自由水、胞內水和結合水3種相態，這與多數植物種子的水分組成相似(Malgorzataetal.， 2007； 李然等， 2009； Anantaetal.， 2012)。但吸水過程中，各相態水的峰面積即含水量變化規律并不相同： 合歡種子胞外自由水和胞內水的峰面積呈“S”型增加趨勢，而結合水的峰面積在前期(0～4 h)略有上升，但差異不顯著，6 h時峰面積突然顯著下降，隨后波動下降，所以總的來說結合水呈下降趨勢，這與玉米(Zeamays)種子萌發過程中的結合水變化趨勢相同(彭宇飛， 2018)。

吸水過程中種子內不同相態水分是可相互轉化。 在0 h時，合歡種子內部的水分多為胞外自由水。隨著浸種時間延長，胞外自由水含量雖在持續上升(峰面積在增加)，但比例卻略有下降，這主要是由于部分胞外自由水與種子中的一些大分子物質結合，轉化為起溶劑作用的胞內水(宋平等， 2016)。當胞內水的含量增加后，種子中的細胞開始活化，代謝更加旺盛，可溶性小分子物質的濃度增加，當胞內水達到一定飽和程度后種子就具備了萌發條件。浸種過程中水稻種子各相態水分的變化規律與合歡種子類似(宋平等， 2015)，而彭宇飛(2018)發現玉米(Zeamays)種子萌發中的結合水峰面積也就是含量呈現先迅速增加后逐漸減小的趨勢，胞內水含量持續上升，胞外自由水含量則為先減小后持續增加的趨勢，這可能由于玉米種子在吸水過程中，大部分淀粉分解為葡萄糖，可溶性蛋白質被直接氨基酸化，非可溶性蛋白被水解成水溶性較小的小分子物質，水分大量參與細胞活化，與種子中的親水膠體結合。吸水過程中結合水T2a的峰頂點、峰結束時間發生左移，也就是說吸結合水的流動性在減弱，這主要是由于吸水過程中結合水含量下降幅度較大，所剩結合水較少，為了吸附種子中的大分子物質，需使T2a束縛能力進一步增強，從而造成峰左移，宋平(2016)對水稻浸種過程中的水分研究也得出相同結論。胞外自由水T2c在吸水0～6 h內也明顯發生峰左移，可能是胞外自由水開始向胞內水轉化，種子內的蛋白，淀粉等物質活化增多，水分膠合更加緊密，結合能力更強，合歡種子吸水6 h時，結合水的含量陡然下降，胞外自由水的含量急劇上升，可能與代謝物質突然變化有關，具體原因有待進一步研究。但是在糙米浸種過程中，3個峰則隨著時間推移，向右移動，這可能因糙米是淀粉類種子，內部淀粉等大分子物質吸水膨脹，細胞間隙變大，使得氫質子所受束縛力下降(劉瀟等， 2018)。

4 結論

1) 運用MRI技術無損觀察了合歡種子吸水規律： 種孔為初始吸水位點，水分由種孔進入后在向合點端移動的過程中主要有3條路徑： 一是水分進入種皮，通過兩側維管束運輸； 二是水分到達胚根，通過種皮與子葉的縫隙遷移至合點端，同時進入子葉外側； 三是通過胚根進入胚軸，經子葉向合點端移動。水分在子葉外側的移動速度比中間部分快。

2) 回歸分析發現，合歡種子水分質量與峰面積呈很好的線性關系：S=21 132X+695.0，R2=0.996 8。

3) 用T2反演圖譜可區分出種子內部水分的相態，浸種過程中合歡種子主要存在3種相態的水，分別為結合水、胞內水和胞外自由水。

4) 合歡種子吸水過程結合水含量逐漸減少，比例整體呈下降趨勢； 胞內水含量呈上升趨勢，所占比例先上升后逐漸穩定。胞外自由水與胞內水變化趨勢盡管相同，但胞內水含量增加更顯著。各相態的水分在吸水過程中一直在相互轉化，含量處于動態變化之中。