轉BtCry1Ac與API基因107楊對節肢動物群落多樣性及穩定性的影響*

任敏霞 李 探 張子恒 曾月霞 王利峰 楊敏生,4 劉軍俠,4

(1.河北農業大學林學院 保定 071000； 2.河北省承德市興隆縣行政審批局 承德 067000；3.湖南省衡陽市林業科學研究所 衡陽 421200； 4.河北省林木種質資源與森林保護重點實驗室 保定 071000)

長期采用常規農藥防治農林害蟲，會導致害蟲產生抗藥性、害蟲再猖獗及殺蟲劑污染環境等嚴重問題，轉基因植物應用為防治蟲害提供了一條新途徑(周曉靜等， 2018； 趙蓬暉等， 2010)。目前已成功將抗蟲基因轉入多種植物，且部分已進入田間釋放與商業化種植階段(楊雙， 2018)，但其對靶標、非靶標生物及生態環境的影響存在爭論(姜韜， 2018； 夏敬源等， 1999； 武二忠， 2011； 凌閔， 2020)，轉基因植物在帶來經濟效益的同時，其生態安全性問題不容忽視。對其生態安全性研究主要集中于： 外源基因的穩定性、靶標害蟲是否產生抗性、對非靶標生物的影響、對群落結構的影響、對土壤微生物的影響、是否會產生基因漂移與水平轉移及其直接或間接的環境影響。有研究發現外源基因能穩定存在于植物中(李立， 2009)，也有研究發現轉基因楊樹外源基因表達量產生變化，發生了基因沉默現象(呂威等， 2018)。目前研究表明轉基因楊樹對靶標害蟲表現出較高抗性，個體數量顯著減少(任亞超， 2013； 王璞等， 2020)，且抗蟲性可以持續到下一代，延緩下一代幼蟲的發育(劉冬艷等， 2015)。轉基因楊樹(Populus)在抑制靶標害蟲的同時，對非靶標生物的影響存在一定爭論，多數研究結果表明未對非靶標害蟲及天敵產生明顯不利影響(胡建軍等， 2010； 田亞坤， 2014)，甚至對天敵具有一定增殖作用(姚麗等， 2016)，但也有研究表明轉基因楊樹對靶標害蟲的持續控制作用導致非靶標害蟲葉蜂(李探等， 2018)及刺吸類害蟲數量有所增加(陳輝惶等， 2012)，寄生性天敵種類與數量相對減少(張芳， 2004； 胡建軍等， 2007)。到目前為止的研究未發現對群落、土壤微生物及環境的明顯不利影響(Wangetal., 2018； 胡建軍等， 2010)。

楊樹因其速生、用途廣泛、基因組小、易離體操作等特點，被用作轉基因林木研究的模式樹種(睢韡等， 2019； 丁莉萍， 2016)。轉基因林木生態安全性及對環境的影響，可能需較長時間才能顯現出來，因此需對其進行長期監測。此外，采用常規方式及嫁接方式繁殖的轉基因楊樹抗蟲性均較高； 嫁接繁殖的轉基因楊樹還可有效避免或降低外源基因發生漂移及轉移的風險，提高其環境安全性(王智， 2014)。目前對嫁接繁殖轉基因楊樹的群落影響研究較少，本研究以嫁接轉基因107楊(Populus×euramericana‘Neva’)為對象，探討嫁接轉基因楊樹對節肢動物的群落組成、多樣性及穩定性的影響，為轉基因楊樹生態安全性評價積累數據，并為其推廣與應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗林分為伐根嫁接的轉基因107楊(BtCry1Ac和API基因)，株系#1、#2、#3、#9均為經室內篩選，對鱗翅目害蟲美國白蛾(Hyphantriacunea)和楊扇舟蛾(Closteraanachoreta)等具有高抗蟲性，轉入基因的毒蛋白表達水平為#1>#2>#9>#3(楊艷麗等， 2012)。于2014年在107楊伐根上嫁接轉基因107楊各株系及對照(未轉基因107楊為歐美楊107號，屬于美洲黑楊×歐洲黑楊“無性系”，P.×euramericanacv.‘74/76’)1年生枝條，成林后用于試驗調查。2015—2019年的林齡分別為2、3、4、5、6年。

1.2 試驗地概況

試驗地位于唐山市灤南縣國營林場苗圃，灤南縣屬暖溫帶沿海半濕潤區大陸性氣候，年均氣溫11℃，年均降水量約660 mm，年均日照2 853 h，無霜期186 天。試驗樣地采用隨機區組設計，劃分為4個區組，每個區組種植轉基因107楊株系#1、#2、#3、#9及對照107楊(CK)各30 株(5 列× 6 行)，區組內株系間隨機塊狀排列，株距為2 m，行距5 m，區塊面積為300 m2，不同區組以黑楊(美洲黑楊×歐洲黑楊“無性系”)作為隔離帶，隔離帶寬度4 m，整塊地地形地貌氣候一致，除正常的水肥管理外，均未施用化學農藥。

1.3 調查方法

調查于2015—2019年4—10月進行，每20～25天調查1次。采用隨機取樣方法，在每個區組中各株系分別隨機選取5株樣樹，調查其上節肢動物種類與數量。樹冠調查： 在選取的植株東、西、南、北4個方向，上下各選取50 cm樣枝，觀察并記錄樣枝上節肢動物種類與數量。主干調查： 調查樣株距地表3 m內主干上節肢動物種類與數量。地面調查： 在選取的樣地內按照五點式取樣法，選取5個1 m×1 m的樣方，記錄節肢動物種類與數量。對于野外調查不能鑒定的種類，將其編號，裝入酒精試管中，帶回實驗室進行鑒定(張巍巍等， 2011； 胡金林，1983)。

1.4 試驗林基本生長情況

采用隨機取樣的方法，每個小區隨機選取5株樹，共100株，對試驗林基本生長狀況進行了調查。隨年份的變化，樹高、胸徑及枝下高均表現為一定程度的增長，不同年份轉基因107楊生長量產生波動，#2株系相對穩定，#3株系生長量相對較低。

1.5 數據分析方法

通過以下公式進行群落特征指數分析。

1)Shannon-Wiener多樣性指數(diversity index):

式中：S為物種數；Pi為相對多度。

2)Pielou均勻度指數(evenness index):

J=H′/Hmax，Hmax=lnS。

式中：Hmax為給定物種完全均勻時的群落多樣性指數；S為物種數。

3)Berger-Parker優勢度指數(dominance index) :

C=Nmax/N。

式中：Nmax為優勢類群的數量；N為群落中總的個體數。

4)通過以下指標比較群落中不同株系的穩定性，值越大說明在種間數量上的制約作用相對較大，天敵物種數相對較多，對植食性昆蟲有較強的制約作用，表明群落相對穩定。Ss/Si： 總群落物種數與群落總個體數比值；Sn/Sp： 捕食性天敵與植食性昆蟲物種數比值；Sa/Sb： 捕食性天敵與植食性昆蟲個體數比值；Sp/Sb： 植食性昆蟲物種數和個體數比值；Sn/Sa： 天敵物種數和個體數的比值。

1.6 數據處理

依據轉基因107楊調查數據，逐年統計節肢動物組成以及節肢動物不同功能類群種類和數量，比較不同株系不同年度間轉基因107楊節肢動物群落及各功能類群組成、群落特征指數及穩定性差異。

采用PAST2.17計算轉基因107楊群落特征指數，利用SPSS 21.0中單因素(One-way ANOVA)方差分析對轉基因107楊亞群落組成、群落特征指數進行差異顯著性分析。雙因素(Two-way ANOVA)方差分析對轉基因107楊不同株系和不同年份亞群落組成及群落特征指數進行差異顯著性分析。相關數據整理、繪圖與制表在Microsoft Excel 2010中完成。

2 結果與分析

2.1 節肢動物群落基本組成

節肢動物群落基本組成見表1。共獲得節肢動物54 091頭，分屬13個目。節肢動物群落物種數以鱗翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)與蜘蛛目(Araneida)占優勢。個體數量以鱗翅目占優勢，其次為半翅目(Hemiptera)、膜翅目、蜘蛛目、鞘翅目、雙翅目，分別占5年數據總和的48.2%、15.0%、14.2%、8.5%、8.4%、4.1%。脈翅目(Neuroptera)、直翅目(Orthoptera)與其他類群個體數量相對較少，趨于穩定。

表1 節肢動物群落基本組成①Tab.1 The basic composition of arthropod community

2.2 轉基因107楊亞群落組成

2.2.1 不同年份轉基因107楊亞群落組成 分析轉基因107楊亞群落組成，包括害蟲、天敵和中性節肢動物物種數和個體數。

1)轉基因107楊害蟲亞群落組成 轉基因107楊害蟲亞群落物種及個體數如圖1、2所示。由圖1可見，在同一年份，轉基因107楊與對照107楊的物種數無顯著差異，隨年份變化物種數表現為一定增長趨勢。由圖2可見，同一年份的轉基因107楊各株系的害蟲亞群落個體數量均顯著低于對照107楊(P<0.05)。調查數據顯示： 主要靶標害蟲楊扇舟蛾、美國白蛾數量為對照107楊林分較多，各株系總體低于對照。個體數量隨林齡變化有一定波動，各株系間楊扇舟蛾個體數量在林齡2 、4、5年相對較多，3、6年相對較少； 美國白蛾個體數量在林齡2、5年相對較多，林齡6 年明顯減少。綜合以上分析，轉基因107楊對害蟲亞群落的物種數影響不顯著，但能有效控制靶標害蟲的個體數量，表現出持續抗蟲效果。

圖1 轉基因107楊害蟲亞群落物種數Fig. 1 Quantity of species of pest sub-community in transgenic poplar 107同一林齡不同小寫字母代表同一指標不同株系在0.05水平下差異顯著，下同。Different lowercase letters in the same age mean that different strains of the same index have significant differences at the level of 0.05, the same below.

圖2 轉基因107楊害蟲亞群落個體數Fig. 2 Quantity of individual of pest sub-communityin transgenic poplar 107

2)轉基因107楊天敵亞群落組成 轉基因107楊天敵亞群落物種及個體數見圖3、4。由圖3可見，同一年份轉基因107楊天敵亞群落物種數與對照107楊無顯著性差異(P>0.05)，物種數在林齡2、4年相對穩定，5、6年增多。由圖4可見，同一年份轉基因107楊天敵亞群落個體數與對照107楊差異不顯著(P>0.05)，個體數量在林齡6年相對較多，與其余年份相比呈上升趨勢，主要是由于瓢蟲(Coccinellidae)類及蜘蛛類節肢動物類群個體數量增多如異色瓢蟲(Harmoniaaxyridis)個體數量在林齡3、6年相對較多，2、4、5 年相對較少，狼蛛(Tarantula)個體數量隨年份變化呈現明顯增長趨勢。上述結果表明轉基因107楊在抑制靶標害蟲的同時，天敵亞群落物種及個體數量沒有減少，后期呈現一定增加趨勢。

圖3 轉基因107楊天敵亞群落物種數Fig. 3 Quantity of species of natural enemy sub-community in transgenic poplar 107

圖4 轉基因107楊天敵亞群落個體數Fig. 4 Quantity of individuals of natural enemysub-community in transgenic poplar 107

3)轉基因107楊中性節肢動物亞群落組成 轉基因107楊中性節肢動物亞群落物種及個體數見圖5、6。由圖5可見，同一年份轉基因107楊與對照107楊物種數不存在差異顯著性(P>0.05)，隨年份變化物種數略有下降。由圖6可見，同一年份轉基因107楊與對照107楊中性節肢動物個體數量無顯著差異性(P>0.05)。隨年份的變化個體數量產生波動，林齡5、6 年個體數量與其余各年份相比呈明顯增長趨勢，其他年份表現為林齡3年與2、4 年相比個體數量增多，2、4年波動較小變化不明顯。例如家蟻(Monamoriumpharaonis)、家蠅(Muscadomestica)在林齡2、4年個體數量相對穩定，變化不大，林齡5、6年與2、4年相比個體數量呈增長趨勢。綜上所述，轉基因107楊對中性節肢動物群落物種及個體數量無顯著影響，隨年份變化個體數量表現為一定程度的增加。

圖5 轉基因107楊中性節肢動物亞群落物種數Fig. 5 Quantity of species of neutral arthropod sub-community in transgenic poplar 107

圖6 轉基因107楊中性節肢動物亞群落個體數Fig. 6 Quantity of individuals of neutral arthropod sub-community in transgenic poplar 107

2.2.2 轉基因107楊亞群落組成雙因素方差分析轉基因107楊亞群落組成雙因素方差分析見表2。轉基因107楊不同株系對害蟲亞群落物種及個體數影響顯著(P<0.05)，對天敵與中性節肢動物亞群落物種、個體數量影響均不顯著(P>0.05)。年份對各亞類群落物種、個體數影響均顯著(P<0.05)，株系與年份交互影響不顯著(P>0.05)。上述分析表明，轉基因107楊對害蟲亞群落個體數量影響較大，對天敵及中性節肢動物亞群落無顯著影響，年份間各亞類群落物種、個體數變化較大。

2.3 轉基因107楊節肢動物群落特征指數

轉基因107楊節肢動物群落特征指數見表3。同一年份轉基因107楊節肢動物群落多樣性、均勻度指數均顯著高于對照107楊，優勢度指數顯著低于對照107楊(P<0.05)，各株系間差異不顯著(P>0.05)。整體來看，#2株系隨年份變化波動較小，多樣性、均勻度指數較高，優勢度指數較低，群落結構較為穩定。轉基因107楊節肢動物群落特征指數隨年份的變化表現為林齡2、4年波動較小，5、6年多樣性、均勻度指數上升，優勢度指數降低。綜合以上分析表明，轉基因107楊對群落特征指數未產生顯著不利影響，隨年份變化表現出更為穩定的趨勢。

表2 轉基因107楊亞群落組成雙因素方差分析①Tab.2 Two-factor analysis of variance for sub-community composition in transgenic 107 poplar

表3 轉基因107楊節肢動物群落特征指數①Tab.3 Community characteristic index of transgenic 107 poplar arthropods

轉基因107楊節肢動物群落特征指數雙因素方差分析表見表4。可見，轉基因107楊群落特征指數受不同株系及林齡影響顯著，株系與林齡的交互作用對多樣性指數影響顯著(P<0.05)，而對均勻度及優勢度指數無顯著影響(P>0.05)。

表4 轉基因107楊節肢動物群落特征指數雙因素方差分析表Tab.4 Two-factor analysis of variance of index in transgenic 107 poplar arthropod community characteristics

2.4 轉基因107楊穩定性分析

轉基因107楊節肢動物群落穩定性結果見表5。可知： 轉基因107楊Ss/Si，Sp/Sb，Sa/Sb指標均顯著高于對照107楊(P<0.05)，表明轉基因107楊物種數多，個體數量少，轉基因107楊在種間數量上制約作用強于對照107楊，轉基因107楊Sn/Sa，Sn/Sp指標與對照相比差異不顯著(P>0.05)，表明轉基因107楊與對照107楊捕食性天敵物種數與個體數無明顯差異。在林齡5、6 年，#3株系穩定性有所下降，與其他株系差異顯著，其余年份各株系間差異不顯著，#2株系隨年份變化保持較高穩定性。綜上所述，轉基因107楊穩定性高于對照107楊。

表5 轉基因107楊穩定性分析①Tab.5 Stability analysis of transgenic 107 poplars

3 討論

利用不同方式進行轉基因楊樹繁殖均具有較高抗蟲性，嫁接繁殖還可提高其環境安全性(陳盼飛， 2016)，因此本研究以嫁接轉基因107楊為對象，通過研究轉基因107楊對節肢動物群落多樣性及穩定性的影響，為其生態安全性評價提供依據。轉入基因能否穩定存在與表達是其能否高效抗蟲及保持較高環境安全性的重要因素，且轉基因楊樹對靶標害蟲的抗蟲效果是其應用的關鍵，目前研究表明轉不同類型的抗蟲基因均對靶標害蟲保持較高抗蟲性(胡建軍等， 2010)，且毒蛋白的表達量越高，抗蟲效果越好(夏蘭芹等， 2000)。本研究表明轉抗蟲基因楊能有效抑制靶標害蟲，對靶標害蟲具有持續的抗蟲效果，原因可能是由于轉入基因中的毒蛋白在植株體內穩定持續高效表達。轉基因107楊在抑制靶標害蟲的同時，對非靶標生物的影響同樣是生態安全性評價的重要內容，任何一個物種的變化都會對其他物種產生直接或間接的影響，進一步對群落產生影響，因此轉基因楊樹在抑制靶標害蟲的同時，對非靶標害蟲的影響同樣不容忽視。本研究發現同一林齡轉基因107楊害蟲亞群落個體數量低于對照，天敵及中性節肢動物亞群落物種及個體數量無明顯差異，隨林齡的變化部分天敵與中性昆蟲個體數量表現出一定程度增多，表明轉基因107楊對天敵及中性節肢動物亞群落種類與數量未造成不利影響，與Zhang等(2011)研究結果相似，原因可能是由于轉入的抗蟲基因具有選擇性，在抑制靶標害蟲的同時對非靶標生物不具有抑制或致死效應。

節肢動物群落的多樣性、均勻度指數越高，優勢度指數低，表明群落結構越復雜，物種分布越均勻，群落結構更穩定。本研究結果顯示轉基因107楊節肢動物群落多樣性、均勻度指數高于對照，優勢度指數低于對照，表明轉基因107楊對節肢動物群落未產生顯著負面影響，這與他人(姜文虎等， 2018； Zuoetal., 2018； Zhangetal., 2011)的研究結果相似。轉基因107楊群落特征指數隨年份變化產生波動，年份對其影響較大，差異顯著，可能是由于調查期間選取的調查時間、天氣、溫度等其他因素的影響。對轉基因107楊穩定性進行分析，轉基因107楊穩定性顯著高于對照107楊，表明轉基因107楊相對穩定，這與劉潔(2015)的研究一致。

4 結論

轉基因107楊對主要靶標害蟲具有持續的抗蟲效果，對天敵及中性節肢動物群落未產生不利影響，生態安全性相對較高。溫度、濕度等氣候因素、毒蛋白的表達及其他各種因素同樣會對天敵、害蟲及中性昆蟲的種類與數量產生影響，今后的研究中需結合其他各方面因素進行長期監測，為進一步評價轉基因107楊生態安全性提供依據。