豬瘟病毒和豬圓環病毒2型混合感染的PCR診斷

李曉麗

承德市動物疫病預防控制中心，河北承德 067000

近年來，隨著生豬養殖的迅速發展，規模化豬場疫病呈現出新的特點，主要表現為動物疫病種類多發，多種豬病混合感染狀況日趨嚴重，隱性感染、非典型癥狀和混合感染越來越普遍，導致發病率和死亡率的增加，給豬病的防控和凈化工作帶了來巨大的挑戰。

豬瘟（CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。當前豬瘟以溫和型、非典型豬瘟為主，發病特點為感染時間長、潛伏期長、免疫無效和無季節性[1]。

豬圓環病毒中的PCV2與斷奶仔豬多系統衰竭綜合征、豬呼吸道病復合征及豬增生性和壞死性肺炎等[2,3]的發生密切相關，又以對斷奶仔豬多系統衰竭綜合征的影響最為嚴重。豬圓環病毒（PCV）2型單獨感染癥狀較輕，但混合感染或免疫刺激后，PCV2的致病性會提高[4]。PCV2可侵害豬的免疫系統，感染后可造成免疫抑制，繼發其他細菌和病毒感染，對生豬養殖業會造成巨大的經濟損失[5～7]。

以上兩種病毒病是嚴重影響豬群健康和危害豬場生產的主要病毒病[8]。

聚合酶鏈式反應（PCR）類似于DNA的天然復制過程，由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成，具有特異性強、靈敏度高、對標本純度要求低、簡便、快捷等優點，越來越多的應用于動物疫病的診斷。本文通過對一規模豬場病死豬采集血液和組織病料進行實驗室檢測，確定感染疫病，繼而制定有針對性的防控措施。

1 主要臨床癥狀

病豬體溫升高到41 ℃，厭食畏寒，體毛雜亂無光澤，皮膚黃染，有的呈丘疹狀，指壓不褪色，無神經癥狀，耳部及腹部皮膚呈深紅色，會陰部皮下出血，有的甚至出現壞死。

2 病理變化

病豬皮下呈彌漫性出血，淋巴結腫大，腹股溝部淋巴結及腸系膜淋巴結尤為明顯，切口呈黑紅色。肝臟腫大，表面有不均勻的壞死灶，脾周邊有出血性梗死。肺部呈淺紅色，伴有局灶性點狀出血，氣管中有淺粉紅色分泌物，膀胱黏膜有大量出血點，心包有少許積液，心臟外膜有點狀出血點。

3 實驗室PCR檢測診斷

3.1 材料和方法

3.1.1 檢測樣本

無菌采集某規模豬場病死豬全血樣本和組織樣本（脾臟、淋巴結等）共19份。

3.1.2 主要試劑

非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒購自青島立見診斷技術發展中心，豬瘟病毒通用型RT-PCR檢測試劑盒、豬圓環病毒2型實時熒光PCR檢測試劑盒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經典株和高致病性變異株雙重實時熒光RT-PCR檢測試劑盒均購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司。磁珠法核酸提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，柱式提取試劑盒購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司。

3.1.3 主要儀器設備

JY96G PCR擴增儀、JY600c核酸電泳儀、JY-04S-3C凝膠成像與分析系統，Roche LightCycler 96熒光定量PCR儀、Tguide S32自動核酸提取儀。

3.1.4 實驗方法

按照試劑盒說明書進行樣品的前處理、核酸提取及PCR檢測。

3.2 檢測結果

非洲豬瘟病毒核酸檢測呈陰性。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型經典株和高致病性變異株核酸檢測均為陰性。

豬瘟病毒核酸檢測結果：按照試劑盒說明書進行核酸產物電泳，選擇DNA Marker（100-600bp）作為參照，根據RT-PCR產物電泳結果，陰陽性對照均成立，檢測的19份樣品中共有13份樣品擴增出了豬瘟病毒長度為236 bp的特異性片段，陽性率為68.42%，陽性樣品編號為：1、2、3、4、5、6、7、10、11、12、13、14和18。

豬圓環病毒2型核酸檢測結果：經熒光定量PCR儀檢測，陰陽性對照成立，陰性對照無Ct值及曲線，陽性對照Ct值為23.9，檢測的19份樣品中有8份樣品Ct值均小于等于30，且出現明顯的擴增曲線，判為陽性，陽性率為42.10%，陽性樣品編號為：1、2、4、5、6、7、13和14。

以上可以看出，有5份樣品只感染了豬瘟病毒，豬瘟病毒單一感染陽性率為26.32%，在感染豬瘟病毒的13份樣品中，豬圓環病毒2型的感染率達到了61.54%，而感染了豬圓環病毒2型的豬全部感染了豬瘟病毒，豬瘟病毒和豬圓環病毒2型都呈陽性者共8份，混合感染率為42.10%，詳細結果見表1和表2。

表1 CSFV和PCV2檢測結果

表2 CSFV和PCV2總感染結果

4 分析與討論

通過病毒核酸檢測結果，可以得出如下結論。①該豬場豬瘟病毒陽性率較高，推測導致病豬死亡的主要原因為豬瘟，生豬受豬瘟病毒影響較大；②豬瘟病毒和豬圓環病毒2型混合感染率較高，達到了42.10%，兩種病混合感染較為嚴重；③豬圓環病毒2型單一感染幾乎沒有，感染了豬圓環病毒的豬均感染了豬瘟病毒，可能與豬圓環病毒造成機體免疫抑制，引起豬體免疫缺陷有關。

養豬場受豬瘟威脅非常大，前些年對生豬實施國家強制免疫后，豬瘟發病率有所下降，但隨著豬瘟退出國家強制免疫計劃，該病的發病率又呈現了波浪式上升趨勢[9]，夏偉等檢測結果顯示，豬瘟病毒檢出率呈逐年升高趨勢[10]。豬圓環病毒2型的檢出率近年來一直居高不下，由于其屬于免疫抑制性疾病，感染后可引起被感染豬的免疫缺陷，大大增加了動物的發病率和死亡率，其高發病率和高死亡率，已逐漸成為研究熱點。同時，PCV2滅活疫苗免疫效果不理想，增加成本消耗，在養殖場中未能大面積使用[11]，也是導致其高感染率的原因。

5 防控措施

豬瘟病毒和豬圓環病毒2型均是影響養豬效益的重要疫病，嚴重威脅豬群健康、降低飼料報酬，對豬場造成重大經濟損失。尤其是豬圓環病毒，因其具有免疫抑制功能，感染后可引起豬的免疫缺陷，繼發其他細菌或病毒感染，對養豬場的危害更為嚴重。所以應采取有效的防控措施，有條件的豬場可以開展兩種疫病的凈化工作，達到消滅傳染源，凈化疫病的目的。暫時沒有條件的豬場可以從以下兩個方面加強防控。

5.1 科學制定免疫程序，提高豬群抗病力。現階段，接種疫苗仍然是防控豬瘟和豬圓環病毒病的有效方法，規模豬場應按程序做好豬瘟、豬圓環等病毒病的免疫工作，同時做好抗體檢測工作，發現抗體不合格及時補免。

5.2 加強飼養管理，精準防控。應加強豬場的飼養管理及消毒工作，提高豬群抵抗力，最大限度降低豬群死亡率，減少經濟損失，養殖場可以參照非洲豬瘟精準防控措施實施豬場管理。