一株解淀粉類芽孢桿菌的分離鑒定及生物學特性分析

魯 萍，于龍政

1.延邊大學附屬醫院腫瘤內科，吉林延吉 133002；2. 延邊大學農學院，吉林延吉 133002；3.東北寒區肉牛科技創新教育部工程研究中心，吉林延吉 133002

隨著抗生素的廣泛應用，出現藥物殘留、機體耐藥性的產生等諸多問題。因此，目前積極開展替代抗生素的微生態制劑的研究。微生態制劑是從自然界中分離得到的有益微生物，通過微生物工程工藝制作成含有活菌或其代謝物的活菌劑。微生態制劑可以平衡宿主腸道內的微生物菌群，調節免疫力，其代謝物可以抑制病原菌，具有安全、無藥物殘留、有利于動物的生長繁殖等優點，被廣泛重視和應用。解淀粉類芽孢桿菌是廣泛存在于自然界中的桿菌，解淀粉類芽孢桿菌的分離鑒定報道較多，但多數是從植物中分離。反芻動物的瘤胃中棲息著多種微生物群，本試驗旨在從羊瘤胃內分離菌源，對其進行菌種鑒定、生長情況、耐酸、耐膽鹽、抑菌作用等研究，以期為微生態制劑的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

教學牧場的羊瘤胃內容物，RCM培養基、藥敏紙片購自青島海博生物技術有限公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生物有限公司，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌為實驗室從腹瀉病例分離菌株。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化

從教學牧場的羊瘤胃瘺管處采集羊瘤胃內容物物，用無菌PBS稀釋后80 ℃水浴加熱10 min。熱處理后的內容物涂布在RCM固體培養基中，37 ℃培養24 h。挑取菌落，反復純化分離3次，得到純培養物。對純培養物進行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.2 分子生物學鑒定

對分離純化的菌進行16S rRNA鑒定分析。用細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，進行PCR擴增。引物為細菌16S rRNA基因通用引物，上游引物 27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACG CT-3'，下游引物1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGA CTTCACCCC-3'。PCR擴增采用20 μL反應體系，其中:2×Taq Mix 10 μL，10 nM引物各1 μL，菌液DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。PCR擴增的反應條件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行35個循環；最后在72 ℃延伸10 min。將PCR產物送至吉林省庫美生物科技有限公司進行測序。利用NCBI數據庫中的BLAST工具對序列進行比對，應用軟件Clustalx和MEGA建立系統發育樹。

1.2.3 生長曲線測定

挑取分離純化的單個菌落接種到液體培養基中培養，制成菌懸液。菌液按照2%的接種量接種到新的RCM液體培養基中，并每隔2 h取樣品，測定其菌液的OD值，38 h后繪制出該菌的生長曲線。

1.2.4 耐酸和耐膽鹽能力測定

耐酸試驗：pH為7.0的PBS用0.1 mol/L的鹽酸分別調節pH至4.0、3.0、2.0，高壓滅菌。取菌懸液0.1 mL，分別加入到裝有9.9 mL上述pH的PBS試管中（3次平行試驗），制成菌懸液，并在37 ℃搖床培養3 h。做3個稀釋度，各取100 μL培養液涂在普通瓊脂培養基平板上，37 ℃培養24 h，平板菌落計數。以原菌液作為對照，計算菌株的存活率。

耐膽鹽試驗：分別稱取豬膽鹽，加入PBS溶解，使其濃度分別為0.1%、0.2%和0.3%，高壓滅菌后備用。取菌懸液0.1 mL，加入到裝有9.9 mL上述濃度的豬膽鹽溶液的試管中（3次平行試驗），充分混勻，在37℃搖床培養3 h。做3個稀釋度，取100 μL培養液涂布在普通瓊脂培養基平板上，37 ℃培養24 h，平板菌落計數。以原菌液作為對照，計算菌株的存活率。

1.2.5 抑菌試驗

將大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，測試分離菌的抑菌特性。將分離菌株在平皿上點種，培養過夜，按照每7 mL的0.7%軟瓊脂接種300 μL指示菌為比例，接種指示菌，37 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑。

2 結果

2.1 菌落及細菌形態

羊瘤胃中分離純化的菌株Y1在RCM培養上菌落呈現圓形、邊緣不整、淡黃色、不透明、大菌落。革蘭氏染色后菌株Y1呈紫色、短桿狀，為革蘭氏陽性菌。

2.2 系統發育樹分析

提取菌液DNA，經27 F和1 492 R引物PCR擴增，得到1.5 kb左右的PCR產物。PCR產物純化后測序。將菌株Y1的16S rRNA序列在GenBank數據庫進行比對，應用Lasergene軟件進行同源性分析，菌株Y1與解淀粉類芽孢桿菌（GenBank No.MK618627, KC355293）同源性最高，為99.7%。應用軟件Clustalx構建遺傳進化樹，應用MEGA軟件繪制遺傳進化樹（圖1）。經分析發現，菌株Y1與解淀粉類芽孢桿菌遺傳距離最近，處于同一進化分支上；與解淀粉芽孢桿菌（GenBank No.KY357304）和枯草芽孢桿菌（GenBank No.X60646）不在同一分支上。

圖1 菌株Y1的系統進化樹

2.3 生長曲線

菌液經過培養，每隔2 h取樣品，測定其菌液的OD值，繪制生長曲線。由Y1生長曲線可知，經過4 h生長遲緩期，進入對數生長期。在14 h進入穩定生長期，34 h后進入衰落期。

2.4 耐酸、耐膽鹽特性

經過不同pH的PBS處理，在37 ℃培養3 h之后，在pH 2.0、3.0、4.0的存活率分別為0、0.15%、51.23%。該菌在pH 3.0條件下可存活，但存活率低。在pH 4.0條件下存活率可達50%以上。

經過不同濃度的豬膽鹽在37 ℃培養3 h之后，在0.1%（w/v）豬膽鹽條件下細菌存活率83.4%，0.2%豬膽鹽條件下細菌存活率為75.3%，0.3%豬膽鹽條件下細菌存活率為66.5%，隨著膽鹽濃度的增加，存活率下降，但仍保持在60%以上，具備耐膽鹽特性。

2.5 抑菌試驗

以大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，檢測該菌的抑菌效果。結果沒有抑菌圈出現，表明分離到的菌對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌沒有抑菌作用。

3 討論

本研究從羊瘤胃內容物中分離到一菌株，經過形態學觀察和16S rRNA鑒定，該菌株與解淀粉類芽孢桿菌形態相同，革蘭氏陽性菌，同源性高達99.7%、遺傳距離最近，鑒定為解淀粉類芽孢桿菌。

解淀粉類芽孢桿菌培養2 h后進入對數生長期，在培養14 h后進入穩定期；在pH 4.0條件下存活率可達50%以上，在0.3%豬膽鹽條件下細菌存活率為60%以上，表明該菌的生長規律適合腸道內繁殖。為進一步幫助機體消化吸收提供基礎。

大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是腸道主要致病菌。本試驗分離純化的解淀粉類芽孢桿菌對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均無抑制作用。這結果與王政露等人報道的解淀粉芽孢桿菌的結果一致，然而也有報道解淀粉芽孢桿菌對大腸桿菌和沙門氏菌均有抑制作用。這可能與菌株差異有關，因此在開發益生菌劑時應選擇對腸道病原菌具有良好抑制作用的菌株。