蘭州百合脫毒原種球繁育技術(shù)

吳 然，邊光亞，薛少紅，李旭青，宋 濤，齊春蔚，李振勤*

（1.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北 石家莊 050021；2.石家莊市百合研究技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050021；3.石家莊市花卉研究技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050021；4.富邦農(nóng)業(yè)高科技有限公司，河北 石家莊 050021；5.河北盛祥市政園林工程有限公司，河北 石家莊 050021）

蘭州百合（var.）為川百合變種，是我國(guó)唯一的甜百合，也是一種藥食同源的蔬菜，其鱗莖中富含蛋白質(zhì)、淀粉、維生素、氨基酸和微量元素等多種成分，同時(shí)還含有百合皂苷、秋水仙堿等多種藥用成分，具有良好的營(yíng)養(yǎng)保健功效。近年來，市場(chǎng)對(duì)蘭州百合的需求量不斷增加，其種植面積也在不斷擴(kuò)大，2019年，蘭州百合種植面積達(dá)6 666.67 hm，產(chǎn)量約4萬t，外銷量3.5萬t左右。但是，蘭州百合種植戶多年來靠自然生長(zhǎng)的母籽進(jìn)行繁育，導(dǎo)致品種混雜、種球自然退化和病蟲害累積嚴(yán)重，從而致使商品種球產(chǎn)量下降、產(chǎn)品的獨(dú)頭率降低，難以滿足食、藥用百合市場(chǎng)對(duì)優(yōu)質(zhì)蘭州百合商品種球的需求。研究培育脫毒種球，實(shí)現(xiàn)蘭州百合的無毒化生產(chǎn)，是解決這些問題的最有效途徑。因此，通過開展脫毒及誘導(dǎo)培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)以及組培種球的馴化移栽等試驗(yàn)，總結(jié)形成了蘭州百合脫毒原種球繁育技術(shù)，利用該技術(shù)可獲得較高的莖尖存活率，達(dá)80%以上，同時(shí)病毒脫除率達(dá)85%以上。現(xiàn)將繁育技術(shù)總結(jié)如下，供相關(guān)從業(yè)人員參考。

1 材料選擇

選擇種源明確、生長(zhǎng)健壯、外觀無病毒癥狀的蘭州百合植株，挖取鱗莖后，選取周長(zhǎng)≥10 cm鱗莖的中層鱗片作為繁殖材料。

2 脫毒原原種的獲得

2.1 培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基的配制需按照NY/T 2306—2013《花卉種苗組培快繁技術(shù)規(guī)程》的要求執(zhí)行。根據(jù)組培各階段要求培養(yǎng)基需附加不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，配制3種培養(yǎng)基，配方見表1。

表1 不同培養(yǎng)基配方

2.2 組培苗的獲得

2.2.1 外植體消毒

用毛筆蘸取洗潔精刷洗剝?nèi)〉闹袑喻[片，洗凈后在流水狀態(tài)下沖洗2～3 h，置于超凈工作臺(tái)后移入無菌瓶，倒入75%酒精消毒1 min，再用無菌水沖洗3次，每次1 min；倒入0.1% HgCl，消毒8 min，無菌水沖洗3次，每次1 min，以便充分洗去殘留的HgCl。

2.2.2 接種

將消毒的鱗片用無菌濾紙吸干水分，沿鱗片邊緣切除1 mm的外圍部分，選取鱗片的中部至基部，切成長(zhǎng)×寬約1 cm×1 cm的小塊，凸面向下平鋪放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶1株。將接種好的外植體置于培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，溫度24～26 ℃，光照12 h/d，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx。培養(yǎng)2周內(nèi)，觀察污染情況，及時(shí)將長(zhǎng)菌材料移出培養(yǎng)室。

2.2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)

外植體接種30 d后，鱗片傷口處形成愈傷組織，將獲得的愈傷組織切成0.5 cm×0.5 cm的團(tuán)塊，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)室，溫度24～26 ℃，光照12 h/d，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx條件下培養(yǎng)約35 d后，可獲得0.5 cm以上的不定芽。

2.3 病毒的脫除

2.3.1 熱處理

將暗培養(yǎng)獲得的不定芽切下，轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)箱，32 ℃適應(yīng)7 d，然后在光照14 h/d、溫度（39±1）℃，黑暗10 h/d、溫度（25±1）℃條件下，交替處理25 d。

2.3.2 莖尖培養(yǎng)

以經(jīng)過熱處理的組培苗為脫毒材料，選取生長(zhǎng)正常的植株，在10～80倍解剖鏡下剝?nèi)?.2～0.5 mm莖尖放入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種1株，置于培養(yǎng)室，在25～30 ℃條件下暗培養(yǎng)2～3個(gè)月，在培養(yǎng)期間每隔30 d轉(zhuǎn)接1次，使其繁殖成無性系，單個(gè)觀察培養(yǎng)并分留樣品進(jìn)行病毒檢測(cè)。

2.3.3 病毒檢測(cè)

病毒的檢測(cè)符合NY/T 1744—2009《切花百合脫毒種球標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定。采用多重RT-PCR法對(duì)分留的樣品進(jìn)行百合主要病毒病的檢測(cè)，包括：黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、百合無癥病毒（Lily symptomless virus，LSV）和百合斑駁病毒（Lily mosettle virus，LMoV）的檢測(cè)，檢測(cè)引物參照陳進(jìn)等的引物序列。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，保留陰性的材料為無毒種源進(jìn)行擴(kuò)繁，淘汰陽性材料。

2.4 脫毒原原種繁殖

2.4.1 鱗莖的誘導(dǎo)和增殖

將莖尖培養(yǎng)獲得的病毒檢測(cè)為陰性的無毒材料轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，置于培養(yǎng)室，在24～26 ℃條件下暗培養(yǎng)30～40 d，將增殖生成的叢生芽分割為單株，繼續(xù)轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基，每瓶接種5～6株，24～26 ℃條件下暗培養(yǎng)30～40 d，可誘導(dǎo)出大小不等的百合小鱗莖。

2.4.2 生根培養(yǎng)

將分化出的小鱗莖轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，每瓶接種5～6株，置于培養(yǎng)室，24～26 ℃條件下暗培養(yǎng)，一般40～50 d鱗莖直徑可達(dá)0.5～1.0 cm的出瓶標(biāo)準(zhǔn)。

3 脫毒原種球的獲得

3.1 設(shè)施條件

選擇在背風(fēng)向陽、排灌便利、前茬作物不為蔥蒜等球莖類作物的地塊建設(shè)大棚，棚上覆蓋遮陽網(wǎng)，保證夏季棚內(nèi)最高溫低于25 ℃，門口及通風(fēng)口安裝防蟲網(wǎng)。

3.2 種植前準(zhǔn)備

3.2.1 基質(zhì)配制和消毒

按草炭∶珍珠巖∶河沙＝2∶1∶1的體積比例混勻基質(zhì)，然后用40%福爾馬林50倍液均勻噴灑配制好的基質(zhì)進(jìn)行消毒，噴灑完畢后用塑料薄膜覆蓋24 h，然后揭膜風(fēng)干2周左右，以消除殘留藥物危害。

3.2.2 栽植床準(zhǔn)備

棚內(nèi)建造栽植床，床面寬100～120 cm，床高140～150 cm，床深15～30 cm，2床間留距離25～30 cm的操作通道。

3.2.3 種植前材料處理

將達(dá)到出瓶標(biāo)準(zhǔn)的脫毒原原種整瓶放入4 ℃低溫冷藏室，暗培養(yǎng)60～70 d，用以打破休眠。種植前選擇生長(zhǎng)健壯、根系發(fā)達(dá)的小鱗莖整瓶放入溫度15～20 ℃的棚室內(nèi)，打開瓶蓋后煉苗3 d，然后將鱗莖從瓶?jī)?nèi)取出，立即清洗并盡快種植。

3.3 種植

將基質(zhì)平鋪于栽植床，厚度8～12 cm，將鱗莖按照100～120個(gè)/m的密度種植，種植后覆蓋基質(zhì)1～2 cm，然后澆透定根水。

3.4 栽培管理

3.4.1 溫度管理

出苗前棚內(nèi)溫度宜保持在白天13～15 ℃，夜間5～10 ℃，空氣濕度70%～80%；出苗后整個(gè)生長(zhǎng)期白天宜在18～25 ℃，夜間宜8～12 ℃，空氣濕度80%～90%。

3.4.2 水肥管理

根據(jù)氣候和基質(zhì)的含水狀況合理澆水，整個(gè)生長(zhǎng)期需保證基質(zhì)持水量在60%～70%；展葉后至現(xiàn)蕾前，每隔20 d左右根施0.1%尿素＋0.1%磷酸二氫鉀＋0.1%硝酸鈣；現(xiàn)蕾后葉面噴施氨基酸水溶肥料（Cu＋Mn＋Zn＋B≥20 g/L，氨基酸≥100 g/L）水劑稀釋1 000倍液，每隔20 d噴施1次，共噴施2～3次。

3.4.3 摘蕾

花蕾長(zhǎng)至1 cm左右時(shí)，應(yīng)立即摘除。

3.5 病蟲害防治

百合病蟲害防治以預(yù)防為主，結(jié)合農(nóng)業(yè)防治、生物防治和化學(xué)防治。發(fā)現(xiàn)感染病毒的植株，需及時(shí)拔除銷毀。發(fā)現(xiàn)病蟲害，及時(shí)噴藥，化學(xué)農(nóng)藥的使用需符合NY/T 393—2020《綠色食品農(nóng)藥使用準(zhǔn)則》的規(guī)定。

3.6 種球采收

待植株枯萎后，小心將種球挖出，周長(zhǎng)在14 cm以上的種球可作為生產(chǎn)商品球的繁殖材料，周長(zhǎng)14 cm以下的種球，翌年繼續(xù)種植。