LncRNA PSMA3-AS1靶向miR-379-3p基因對非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲影響的機制研究

郭明珠 梁珍珍 韓晶晶 龐 晶

非小細胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要病理類型，其占肺癌患者的80 %以上[1]。近年來，由于醫學水平的進步，NSCLC的治療取得了一定進展，但患者5年生存率依然較低[2]。目前，NSCLC的發病機制尚未明確，因此探究NSCLC發生發展的分子機制并尋找治療分子靶點尤為重要。人蛋白酶體α亞基3型(PSMA3)的反義RNA1(PSMA3-AS1)是一種長鏈非編碼RNA(lncRNA)，有報道稱，其在食管鱗狀細胞癌(ESCC)組織中表達明顯上調，上調PSMA3-AS1可通過競爭性結合miR-101進而上調EZH2表達增強ESCC細胞的增殖、侵襲和遷移能力，PSMA3-AS1有可能成為ESCC治療的分子靶標[3]。然而，PSMA3-AS1對NSCLC發生發展的影響和分子機制還未知。LncBase Predicted v.2靶基因在線軟件預測顯示，PSMA3-AS1可能與miR-379-3p靶向結合。目前，miR-379-3p對NSCLC發生發展的影響也還未知。本研究主要觀察了PSMA3-AS1和miR-379-3p對NSCLC細胞系NCI-H1299增殖、遷移和侵襲的影響及PSMA3-AS1能否靶向miR-379-3p發揮作用，以期為NSCLC的靶向治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞和試劑

正常肺上皮細胞BEAS-2B及NSCLC細胞系NCI-H1299，中國科學院上海細胞庫；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI 1640培養基和MTT，北京索萊寶；miRNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物；Trizol試劑和LipofectamineTM 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；PCR引物、si-PSMA3-AS1及對照序列si-NC、miR-379-3p mimcs及對照序列miR-NC、miR-379-3p抑制劑(anti-miR-379-3p)及陰性對照序列anti-miR-NC，上海吉瑪；兔抗人CyclinD1、MMP2、MMP9、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體，北京中杉金橋生物試劑公司；BCA蛋白檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒，上海碧云天。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 正常肺上皮細胞BEAS-2B及NSCLC細胞系NCI-H1299均用含10 % FBS的RPMI 1640培養基培養。將對數期NCI-H1299細胞接種于6孔板中(1×105個/孔)，參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，分別轉染si-PSMA3-AS1(si-PSMA3-AS1組)、miR-379-3p mimcs(miR-379-3p組)、si-NC(si-NC組)、miR-NC(miR-NC組)、si-PSMA3-AS1與anti-miR-379-3p(si-PSMA3-AS1+anti-miR-379-3p組)、si-PSMA3-AS1與anti-miR-NC(si-PSMA3-AS1與anti-miR-NC組)。轉染6 h后，更換為新鮮培養基。再培養24 h，收集細胞用于后續實驗。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)實驗 用Trizol試劑、miRNA提取試劑盒分別提取細胞中總RNA和miRNA，經逆轉錄生成cDNA后，行PCR擴增。引物序列：PSMA3-AS1上游5'-CGTGAACGTGCACCTGCATC-3'，下游5'-CGTGGAAGGACGTCGTG-3'；GAPDH上游5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA T-3'，下游5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA T-3'；miR-379-3p上游5'-GTCGAAAGTCGT CCCGGTAC-3'，下游5'-CGGTGAACACTTGTGCAC-3'；U6上游5'-CTTCGGCAGCACATA TACTAAAAT-3'，下游5'-AATATGGAACGCTTCACGA-3'。2-△△Ct法計算PSMA3-AS1和miR-379-3p的相對表達水平，其中PSMA3-AS1以GAPDH為內參，miR-379-3p以U6為內參。

1.2.3 MTT實驗 各組轉染后的細胞接種于96孔板中(1.0×104個/孔)，每組設3個復孔，培養24 h。加20 μl MTT(5 g/L)，孵育4 h。加150 μl二甲基亞砜，振蕩混勻，酶標儀(λ=490 nm)測光密度(OD)值。

1.2.4 Transwell實驗 將各組轉染后的細胞調整密度為5×104個/ml。遷移實驗：取100 μl各組細胞懸液加至Transwell上室，500 μl含10% FBS的RPMI 1640培養基加至下室。培養24 h后，用多聚甲醛固定進行，然后用結晶紫染色。置于倒置顯微鏡觀察、拍照，并計數。侵襲實驗：在Transwell上室鋪Matrigel基質膠，自然晾干后，再加100 μl細胞懸液，后續操作同遷移實驗。

1.2.5 Western Blot實驗 RIPA試劑提取細胞中總蛋白，經BCA法定量、SDS-PAGE、轉膜、封閉后，分別用CyclinD1(1∶1000)、MMP2(1∶800)、MMP9(1∶800)一抗4 ℃孵育過夜。洗膜后，再用山羊抗兔二抗(1∶2000)37 ℃孵育1 h。加化學發光試劑，避光顯影后曝光拍照。

由上海生工根據LncBase Predicted v.2靶基因在線軟件預測顯示的PSMA3-AS1與miR-379-3p的結合位點，設計并合成PSMA3-AS1野生型熒光素酶載體(WT-PSMA3-AS1)及突變型熒光素酶載體(MUT-PSMA3-AS1)。將NCI-H1299細胞接種于24孔板中(2.5×104個/孔)，分別共轉染WT-PSMA3-AS1與miR-379-3p mimics或miR-NC、MUT-PSMA3-AS1與miR-379-3p mimics或miR-NC。轉染6 h后，更換培養基。再培養24 h，收集細胞并裂解。3500 r/min離心5 min后，取上清，利用雙熒光素酶活性檢測試劑盒，檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 NSCLC細胞系中PSMA3-AS1和miR-379-3p的表達

與BEAS-2B細胞比較，NSCLC細胞系NCI-H1299中PSMA3-AS1的表達水平升高(P<0.05)，miR-379-3p的表達水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 NSCLC細胞系中miR-379-3p和PSMA3-AS1表達量

2.2 下調PSMA3-AS1對NCI-H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-NC組、si-PSMA3-AS1組NCI-H1299細胞中PSMA3-AS1表達水平分別為(1.00±0.11)、(0.42±0.040，兩者比較差異具有統計學意義(t=14.866，P<0.05)，說明下調PSMA3-AS1的NCI-H1299細胞構建成功。與si-NC組比較，si-PSMA3-AS1組NCI-H1299細胞OD值、遷移數和侵襲數均降低(P<0.05)，與增殖、遷移和侵襲相關的蛋白CyclinD1、MMP2和MMP9的表達水平均下降(P<0.05)，見圖1、表2。

注：A為Transwell檢測下調PSMA3-AS1后NCI-H1299細胞遷移和侵襲，放大倍數×200；B為Western Blot檢測Transwell檢測下調PSMA3-AS1后NCI-H1299細胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達。

表2 下調PSMA3-AS1對NCI-H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 上調miR-379-3p對NCI-H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響

miR-NC組、miR-379-3p組NCI-H1299細胞中miR-379-3p表達水平分別為(1.00±0.11)和(2.76±0.22)，兩者比較差異具有統計學意義(t=21.466，P<0.05)，說明上調miR-379-3p的NCI-H1299細胞構建成功。與miR-NC組比較，miR-379-3p組NCI-H1299細胞OD值、遷移數和侵襲數均降低(P<0.05)，與增殖、遷移和侵襲相關的蛋白CyclinD1、MMP2和MMP9的表達水平均下降(P<0.05)，見圖2、表3。

表3 上調miR-379-3p對NCI-H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖2 Western Blot檢測結果

2.4 PSMA3-AS1靶向調控miR-379-3p

LncBase Predicted v.2靶基因在線軟件預測顯示的PSMA3-AS1與miR-379-3p的結合位點見圖3。miR-379-3p mimics與WT-PSMA3-AS1共轉染NCI-H2170細胞后，細胞熒光素酶活性降低[(0.42±0.04)比(1.00±0.10)，t=16.155，P<0.05)]，而miR-379-3p mimics與MUT-PSMA3-AS1共轉染NCI-H1299細胞后，細胞熒光素酶活性無明顯變化[(0.99±0.09)比(1.01±0.12)，t=0.400，P=0.694)]。下調PSMA3-AS1表達后，NCI-H2170細胞中miR-379-3p的表達升高[(1.66±0.12)比(1.01±0.10)，t=12.484，P<0.05)]。這表明PSMA3-AS1在NCI-H2170細胞中與miR-379-3p靶向結合并負調控其表達。

圖3 PSMA3-AS1與miR-379-3p核苷酸序列的結合位點

2.5 下調miR-379-3p逆轉下調PSMA3-AS1對NCI-H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響

si-PSMA3-AS1+anti-miR-NC組、si-PSMA3-AS1+anti-miR-379-3p組NCI-H1299細胞中miR-379-3p表達水平分別為(1.00±0.11)和(0.38±0.03)，兩者比較差異具有統計學意義(t=16.313，P<0.05)，說明NCI-H1299細胞中miR-379-3p下調。與si-PSMA3-AS1+anti-miR-NC組比較，si-PSMA3-AS1+anti-miR-379-3p組NCI-H1299細胞OD值、遷移數和侵襲數均升高(P<0.05)，細胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達水平均增高(P<0.05)，見圖4、表4。

圖4 同時下調PSMA3-AS1和miR-379-3p后細胞中CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達

3 討論

非小細胞肺癌(NSCLC)的發生發展與原癌基因的激活及抑癌基因的失活有關，探究NSCLC中異常表達的基因分子及對NSCLC發生發展的影響，可為NSCLC的治療提供分子靶點。lncRNA是真核生物中廣泛存在的超度超過200個核苷酸的非編碼RNA，研究已表明，多種lncRNA在NSCLC中異常表達，參與調控NSCLC細胞的惡性表型。Zha等[4]研究顯示，lncRNA NCK1-AS1高表達的NSCLC患者預后較差，lncRNA NCK1-AS1可通過激活細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)促進NSCLC細胞增殖，進而促進NSCLC的進展。Qiu等[5]研究顯示，肺癌組織中lncRNA PVT1表達上調，下調lncRNA PVT1可通過靶向miRNA-526b進而抑制組蛋白甲基化轉移酶(EZH2)表達減弱肺癌細胞A549的細胞活力。這些lncRNA作為促癌基因參與肺癌的發展進程。而lncRNA ZNF674-AS1[6]、LncRNA MIR503HG等[7]lncRNA在NSCLC組織中的表達明顯下調，上調其表達可阻礙NSCLC細胞增殖，抑制肺癌細胞的細胞周期進程，并加劇肺癌細胞凋亡，進而抑制肺癌發展進程。

表4 下調miR-379-3p逆轉下調PSMA3-AS1對NCI-H1299細胞增殖、遷移和侵襲的影響

PSMA3-AS1是今年來新發現的一種lncRNA，目前其影響腫瘤發生發展的相關報道還很少見。本研究首先以正常肺上皮細胞BEAS-2B為對照，采用RT-qPCR法檢測了非小細胞肺癌細胞系NCI-H1299中PSMA3-AS1的表達，結果顯示，PSMA3-AS1在NCI-H1299細胞中的表達明顯高于BEAS-2B細胞，提示PSMA3-AS1可能促進非小細胞肺癌發生發展；進一步下調NCI-H1299細胞中PSMA3-AS1表達后，NCI-H1299細胞OD值、遷移數和侵襲數均降低，且與細胞增殖、遷移和侵襲相關的蛋白CyclinD1、MMP2和MMP9的表達量減少，這說明下調PSMA3-AS1可阻礙NCI-H1299細胞增殖、遷移和侵襲，與Shen等[8]報道的敲減PSMA3-AS1可抑制NSCLC細胞增殖的結果一致，這提示PSMA3-AS1有可能成為NSCLC治療的分子靶點。

lncRNA可發揮miRNA分子海綿作用，通過靶向結合miRNA來調控miRNA靶基因的表達，進而發揮生物學調控作用[9-11]。本研究證實了PSMA3-AS1可在NSCLC細胞系NCI-H1299中靶向結合并負調控miR-379-3p，這與NCI-H1299細胞中PSMA3-AS1表達升高，而miR-379-3p表達降低的結果一致。研究顯示，胃腺癌組織樣品中miR-379-3p呈低表達，上調miR-96-5p可誘導胃腺癌細胞凋亡，miR-96-5p在胃腺癌中發揮抑癌基因作用[12]；miR-96-5p在結腸癌、膠質瘤、卵巢癌和甲狀腺乳頭狀癌等腫瘤中表達升高，促進腫瘤細胞惡性表型，作為促癌基因發揮作用[13-15]。本研究結果顯示，miR-379-3p表達的上調對NCI-H1299細胞的增殖、遷移和侵襲起抑制作用，這提示miR-379-3p也作為抑癌基因阻礙非小細胞肺癌發生發展。Guo等[16]研究顯示，LncRNA UCA1在胰腺癌患者血清外泌體中的表達水平高于健康對照者，其可通過充當miR-96-5p海綿，減輕miR-96-5p對靶基因AMOTL2表達的抑制作用，進而促進腫瘤血管生成和腫瘤生長。本研究結果顯示，下調miR-379-3p表達逆轉了下調PSMA3-AS1對非小細胞肺癌細胞NCI-H1299增殖、遷移和侵襲的抑制作用，進一步提示下調PSMA3-AS1通過靶向負調控miR-379-3p發揮作用。

綜上所述，PSMA3-AS1在非小細胞肺癌細胞系NCI-H1299中呈高表達，而miR-379-3p呈低表達；下調PSMA3-AS1可抑制非小細胞肺癌細胞NCI-H1299增殖、遷移和侵襲，其調控機制與負調控miR-379-3p表達，PSMA3-AS1/miR-379-3p軸可能為非小細胞肺癌的靶向分子治療提供了新的靶點。本研究接下來將進一步探究miR-379-3p的靶基因及下游信號通路對非小細胞肺癌發生發展的影響，并通過動物實驗驗證PSMA3-AS1/miR-379-3p軸在非小細胞肺癌中的作用。