染色體核型分析聯合微陣列分析技術在產前診斷的應用價值

黃婷婷 黎俏 袁慧珍 王欣榮 劉艷秋

江西省婦幼保健院醫學遺傳中心（南昌 330006）

出生缺陷是指嬰兒在出生前所發生的結構、功能或者代謝異常等，導致出生缺陷的常見原因之一為染色體異常。傳統染色體核型分析技術可檢測出染色體數目和大片段結構異常，是產前診斷胎兒染色體異常的“金標準”，但該技術需經過細胞培養導致檢測周期長、分辨力低且無法檢出染色體片段小于5 Mb 的拷貝數變異（copy number variations，CNVs）［1-2］。染色體微陣列分析（chromosome microarray analysis，CMA）則能在全基因組亞顯微水平上檢測出1 kb 以上的CNVs，從而彌補傳統染色體核型分析技術上的不足，增加異常染色體的檢出率，被逐漸應用于醫學領域［3-4］。但CMA 在產前診斷臨床應用中的具體價值評估則需要更大量的數據支持。本研究通過回顧性分析4 854 例胎兒樣本的染色體核型分析及CMA 檢測結果，比較兩種方法優缺點，為更好地產前遺傳咨詢和對胎兒進行預后評估提供依據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 取2020年1月至2021年12月因不同指征在江西省婦幼保健院醫學遺傳中心行介入性產前診斷的孕婦4 854 例。獲取的胎兒樣本同時行染色體核型分析及CMA 檢測，在產前診斷術前孕婦及家屬進行詳細遺傳咨詢并簽署知情同意書。

1.1.2 有創性產前診斷指征 有創性產前診斷指征主要有：血清學生化篩查或無創DNA 產前檢測高風險；胎兒超聲軟指標陽性或結構異常，孕婦高齡（預產期年齡≥35 周歲）；夫婦之一染色體異常；異常孕產史及醫師認為需進行產前診斷的其他情況等。

1.2 方法

1.2.1 介入性產前診斷 根據指征，排除介入性產前診斷禁忌證后，對不同孕周夫婦選擇合適的介入性產前診斷方案（經腹絨毛活檢術、羊膜腔穿刺術或臍靜脈穿刺術），所有孕婦及家屬均行遺傳咨詢并簽署知情同意書。

1.2.2 染色體核型檢查 在無菌條件下將產前診斷術后獲得的胎兒樣本經細胞接種、培養、收獲、制片、G 顯帶后上機，分析5 個核型，至少計數20 個細胞分裂相，必要時增加計數量。

1.2.3 CMA 根據基因芯片實驗操作流程對所獲得的胎兒樣本全基因組DNA 進行分析處理。參照美國醫學遺傳學學會（ACMG）和臨床基因組資源（ClinGen）對CNVs 結果進行致病性解讀，目前分五類［5］：致病性CNVs（pCNVs）、可能致病性CNVs（lpCNVs）、臨床意義未明CNVs（VUS）、可能良性CNVs 和良性CNVs。必要時抽取父母外周血樣本行CMA 驗證，有助于胎兒預后分析。

1.3 統計學方法 用Excel 表格記錄所有數據，SPSS 21.0 軟件進行統計學分析處理。計數資料以例數或百分數（%）表示，應用χ2檢驗對不同組間的差異進行比較，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 檢出的胎兒異常染色體分類情況 共4 854例孕婦因不同指征于我院行有創性產前診斷，通過CMA 聯合染色體核型分析共檢出848 例染色體異常，其中540 例為致病性染色體異常，致病性染色體異常檢出率達11.12%（540/4 854）。致病性染色體異常中除染色體非整倍體外CMA 檢出151 例pCNVs 和可能致病性CNVs，檢出率為3.11%（151/4 854），其中108 例為染色體核型正常，CMA 檢出異常，故CMA 增加胎兒致病性染色體異常檢出率為2.22%（108/4 854）；CMA 還檢出VUS 224 例，占比26.42%。染色體核型分析檢出75例染色體平衡重排（易位/倒位/插入）等，CMA 正常（表1）。

表1 胎兒異常染色體檢出情況Tab.1 Detection of fetal abnormal chromosomes

2.2 不同產前診斷指征CMA 檢出pCNVs 及可能致病性CNVs 情況 CMA 檢出的151 例pCNVs 和可能致病性CNVs 孕婦產前診斷指征不同，主要為胎兒超聲異常83 例，占比54.97%。胎兒超聲異常為結構異常及超聲軟指標陽性，胎兒超聲軟指標包括：單臍動脈、鎖骨下動脈迷走、鼻骨發育不良，心室強光點，腎集合管分離，腎臟回聲增強，脈絡叢囊腫、側腦室增寬及長骨稍短等等；其次為無創DNA 產前檢測高風險30 例，占比19.87%；血清學篩查高風險14 例，占比9.27%。見表2。

表2 pCNVs 及可能致病性CNVs 產前診斷指征分析Tab.2 Analysis of prenatal diagnosis indications of pCNVs and possible pathogenic CNVs

2.3 染色體核型分析與CMA 結果不一致情況分析 染色體核型分析與CMA 結果不一致9 例，其中5 例為染色體核型未見明顯異常，而CMA 提示為不同染色體非整倍體嵌合體，其中4 例終止妊娠，1 例為性染色體46，XX 與47，XXX 嵌合體，目前隨訪中；染色體核型分析發現3 例額外小標記染色體（small supernumerary marker chromosome，sSMC），其中1 例為嵌合體，經CMA 檢測2 例未見明顯異常，遺傳咨詢后繼續妊娠結局良好，1 例明確該變異位于4p16.3q12 及8p23.3p23.1 處，4p16.3q12重復片段約56.23 Mb（pCNVs），8p23.3p23.1 重復片段約8.88 Mb（VUS），經遺傳咨詢后選擇終止妊娠。見表3。

表3 染色體核型分析與CMA 結果不一致情況Tab.3 Inconsistency between chromosome karyotype analysis and CMA results

3 討論

染色體異常是導致出生缺陷的重要原因，包括染色體數目異常和染色體結構異常［6］，如13、18、21-三體綜合征及微缺失微重復綜合征（micro-deletion and microduplication syndromes，MMS）等。MMS 是由于染色體微結構改變所導致的微小片段的缺失和重復，主要是由于特定染色體區域的CNVs 而引起的，目前已明確由CNVs 所致的染色體微缺失及微重復綜合征有300 余種［7］，傳統產前診斷方法是對有產前診斷指征的孕婦進行絨毛活檢、羊膜腔穿刺、臍靜脈穿刺、胎兒活檢等獲取胎兒細胞行染色體核型分析，常規染色體核型分析會漏診5 Mb 以下的CNVs 所致的出生缺陷［8］。CMA 技術分辨率高，可用于未經培養的DNA 樣本，檢測周期短，自動化程度較高，彌補了核型分析的不足［9］。在染色體核型分析正常但超聲提示有結構異常的胎兒中，發現存在6%～7%明確致病或可能致病的CNVs［10］。本研究中共4 854 例孕婦因不同指征于我院行有創性產前診斷，通過CMA 聯合染色體核型分析共檢出848 例染色體異常，其中540 例為致病性染色體異常，致病性染色體異常檢出率達11.12%（540/4 854）。致病性染色體異常中除染色體非整倍體外CMA 檢出151 例pCNVs，檢出率為3.11%（151/4 854），其中43 例為染色體核型分析及CMA 均檢出異常，108 例為染色體核型正常，CMA 異常，CMA 增加胎兒致病性染色體異常檢出率為2.22%（108/4 854）。

2013年CMA 技術己被美國婦產科學會和母胎醫學協會推薦作為一線檢測技術應用于存在產前超聲結構畸形的胎兒中［11］；我國2014年的CMA技術在產前診斷中的應用專家共識中也提出，當超聲提示胎兒存在結構異常時應在使用染色體核型分析技術基礎上同時應用CMA，這樣可以提高pCNVs 的檢出率；同時推薦當胎兒出現結構異常時，CMA 可作為一線檢測手段［12］。有研究［13-14］發現，在骨骼發育異常胎兒中聯合使用CMA 對pCNVs 檢出率較單純傳統染色體核型分析增加8.7%～16%。有數據發現，當胎兒出現單一中樞神經系統異常時，pCNVs 檢出率為5.86%，當胎兒出現多個中樞神經系統異?；蚝喜⑵渌Y構異常時，pCNVs 檢出率為12.3%［15］。在超聲提示胎兒存在先天性心臟病時，CMA 可增加3.0%的pCNVs 或lpCNVs 檢出率［16］。在本研究中CMA 檢出151 例pCNVs，其中83 例產前診斷指征為胎兒超聲結構異?；蛱撼曑浿笜岁栃?，占比54.97%（83/151）。

本研究中發現有染色體核型分析與CMA 結果不一致情況，其中5 例為染色體核型未見明顯異常，而CMA 提示為不同染色體非整倍體嵌合體，其中4 例終止妊娠，1 例為性染色體46，XX 與47，XXX 嵌合體，孕婦及家屬經過遺傳咨詢后考慮繼續妊娠，妊娠結局目前仍在隨訪中；1 例為核型提示7 號染色體三體嵌合體，嵌合比例22%，為單瓶生長，但CMA 結果未見明顯異常，經遺傳咨詢后，孕婦及家屬決定繼續妊娠，隨訪妊娠結局良好，新生兒正常。染色體核型分析與CMA 結果不一致可能與核型分析需要細胞培養有關，在細胞培養過程中存在細胞克隆優勢生長情況，造成染色體數目異常的假性嵌合或嵌合比例不真實，而未經培養的胎兒組織進行CMA 檢查更能說明嵌合真實情況［17］。CMA 計算出的嵌合比例與采用的探針密度相關，不能檢出低比例的嵌合體。在產前診斷應用中發現傳統的染色體核型分析聯合CMA技術可以增加染色體嵌合體的檢出率［18］。

sSMC 是指存在結構異常的染色體，異常片段來源無法通過常規染色體核型分析辨別［19］。有報道sSMC 在新生兒中的檢出率約為0.44‰，在產前診斷胎兒中的發生率為0.75‰［20］。LIEHR 等［21］認為，sSMC攜帶者的臨床表型與sSMC 攜帶的基因劑量效應及印記介導的表觀遺傳相關，當核型分析發現胎兒為sSMC 攜帶時，須行染色體微陣列分析檢測或高通量測序，以便能更準確地判斷sSMC來源及致病性。本研究染色體核型分析發現3 例sSMC，其中1 例為嵌合體，但無法檢測其額外染色體的來源及致病性，經CMA 檢測2 例未見明顯異常，遺傳咨詢后繼續妊娠結局良好，1例明確該變異位于4p16.3q12及8p23.3p23.1 處，4p16.3q12 重復片段約56.23 Mb，累及183 個OMIM 基因。涉及染色體大片段的重復，不排除胎兒可能會具有染色體病的常見臨床表型，綜合考慮為pCNVs；8p23.3p23.1重復片段約8.88 Mb，根據當前數據庫及文獻資料，綜合考慮為VUS，結合其超聲提示胎兒主動脈弓縮窄，透明隔欠清，最后經遺傳咨詢后孕婦及家屬決定終止妊娠。CMA 可對未知來源sSMC 進行檢測，明確該遺傳物質來源及片段大小，更好地指導臨床進行遺傳咨詢［22］。

本研究中染色體核型分析發現75 例平衡重排（易位/倒位/插入）攜帶者，而CMA 未見明顯異常。平衡重排一般不影響妊娠結局，但如果父母中的一方是攜帶者，對未來的妊娠仍有生殖影響［23］。CMA 技術在染色體平衡重排等檢測方面存在一定的局限性，也被視為不能完全替代傳統核型分析技術的重要原因之一。同時隨著CMA 技術在產前診斷中的應用，會增加VUS 的檢出率［24］，VUS 是指CNVs 在目前已知數據庫和文獻資料中未找到對應的片段，且片段內含有的基因功能不明確，與臨床表型相關性也不明確，對VUS 的判讀和解釋仍面臨很大困難及挑戰，增加孕婦及家屬的焦慮，甚至可能造成健康胎兒妊娠的終止。

綜上，染色體核型分析聯合CMA 可以增加異常染色體檢出率［25］，兩種技術相輔相成，為產前診斷及遺傳咨詢提供更準確及詳細的信息。CMA 技術在產前診斷臨床應用中，需通過數據的不斷累積，增強對檢測到的CNVs 進行致病性判讀能力，提高數據的可信度。