馬錢苷通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑抑制燒傷大鼠腸上皮細(xì)胞凋亡發(fā)揮腸黏膜結(jié)構(gòu)保護(hù)作用的機(jī)制

溫海玲 孟祥熙 楊景哲 肖長栓

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院南院區(qū)燒傷整形科（河北承德 067000）

腸損傷是重度燒傷早期最常見的器官損傷，嚴(yán)重?zé)齻烧T導(dǎo)腸道炎癥和氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致腸道屏障損傷和腸道功能障礙［1］。胃腸黏膜屏障是抵御腸道細(xì)菌、毒素等有害物質(zhì)入侵的天然屏障，在多器官功能障礙綜合征的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［2］，保護(hù)腸黏膜在嚴(yán)重?zé)齻闹委熤衅鹬匾饔谩ｋS著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對中醫(yī)藥研究的深入，中醫(yī)治療在危重病領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用，從山茱萸中分離得到馬錢苷屬環(huán)烯醚萜類糖苷，能調(diào)節(jié)炎癥因子，對抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多種細(xì)胞凋亡，具有很好的抗炎、抗氧化能力［3-4］，但其在燒傷領(lǐng)域中的應(yīng)用尚無報(bào)道，在燒傷治療中的作用機(jī)制尚不明確。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）屬于機(jī)體適應(yīng)性調(diào)節(jié)過程，在燒傷等急性損傷后，過度的ERS 可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及引起組織損傷［5］。本實(shí)驗(yàn)通過研究馬錢苷對嚴(yán)重?zé)齻笫竽Ｐ湍c損傷以及ERS 途徑的影響，探討馬錢苷對腸損傷的影響的相關(guān)機(jī)制，為今后進(jìn)一步研究馬錢苷保護(hù)腸道功能的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 成年雄性SD 大鼠（30 只），8 ～12 周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購自北京維通利華公司。大鼠置于SPF 級實(shí)驗(yàn)動物中心通風(fēng)飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為（21±2）℃，相對濕度保持在40%～60%，自由飲水、進(jìn)食。25 ℃條件下進(jìn)行12 h/12 h 光/暗循環(huán)，飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料1 周。本研究經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)（編號：LL2020028）。

馬錢苷購自于武漢恒標(biāo)實(shí)驗(yàn)科技有限公司；0.9%氯化鈉注射液購自于石家莊第四制藥廠；兔抗鼠雙鏈RNA 依賴性蛋白樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（78-kDa glucose-regulated protein，GRP78）和C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）以及半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（B cell lymphoma-2，Bcl-2）和Bax 抗體購自于美國Abcam 公司，TUNEL凋亡檢測試劑盒購自于美國ROCHE 公司。PBS緩沖液、二甲基亞砜、戊巴比妥鈉等均購自于Sigma 公司。分析天平購自于梅特勒托利多公司；常規(guī)手術(shù)器械購自于上海手術(shù)器械廠；離心機(jī)購自于美國Thermo 公司；冰凍切片機(jī)購自于德國Zeis；凝膠電泳系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 將30 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為對照組、燒傷組和干預(yù)組，每組10 只，其中對照組連續(xù)7 d 灌胃給予50 mg/kg 生理鹽水，進(jìn)行假燒傷處理；燒傷組連續(xù)7 d 灌胃給予50 mg/kg 生理鹽水，隨后進(jìn)行燒傷處理；干預(yù)組連續(xù)7 d 灌胃給予50 mg/kg 馬錢苷（5 mg 馬錢苷溶于1 mL 生理鹽水中），隨后進(jìn)行燒傷處理，均為每天灌胃1 次。

1.2.2 動物模型制備 所有大鼠均采用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔麻醉，剪除背部毛發(fā)，將大鼠放置在預(yù)制模板的矩形開口，露出裸露皮膚，同時保護(hù)剩余皮膚，根據(jù)Walker-Mason 燒傷模型，將大鼠裸露的皮膚沉浸在沸水中（100 ℃水浴，背部15 s），造成20%TBSAⅢ°燙傷（下稱燒傷），燒傷后大鼠立即干燥。假燒傷對照組采用溫水（37 ℃水浴，背部15 s）行背部浸泡，燒傷后大鼠立即干燥。燒傷后觀察3 h/6 h，病理檢查證實(shí)燒傷深度。

1.2.3 標(biāo)本收集 燒傷24 h后，所有大鼠均行安樂死（戊巴比妥鈉120 mg/kg，腹腔內(nèi)注射），安樂死后手術(shù)切取腸組織標(biāo)本，清洗干凈，去除脂肪和腸系膜待用，一部分立即浸泡于10%甲醛中固定24 h，一部分裝入凍存管液氮快速冰凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 評價(jià)指標(biāo)

1.3.1 組織病理學(xué)檢測 固定后的腸組織常規(guī)石蠟包埋，切片、蘇木素-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腸道受損情況。

1.3.2 腸組織病理評分 每隔10張切片選擇1張，對選中的切片進(jìn)行組織學(xué)評分［6］。每張切片隨機(jī)選取10 個高倍視野（400 倍）計(jì)分，最終計(jì)算平均值。評分包括炎癥、病變、病變范圍、隱窩破壞程度共4 個方面，具體評分如下［7］，炎癥為0 分（無）、1 分（輕度）、2 分（重度），病變?yōu)? 分（無）、1 分（黏膜下層）、2 分（肌層）、3 分（漿膜層），病變范圍為1 分（1% ～25%）、2 分（26% ～50%）、3 分（51% ～75%）、4 分（76% ～100%），隱窩破壞為0 分（無）、1 分（基底1/3 破壞）、2 分（基底2/3 破壞）、3 分（僅有完整表皮）、4 分（全部隱窩和上皮破壞）。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測腸上皮細(xì)胞凋亡情況 腸組織用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗，收集胰蛋白酶化后腸上皮細(xì)胞，使用Annexin V-FITC/PI 檢測試劑盒，按照制造商說明，通過流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞凋亡；使腸上皮細(xì)胞重新懸浮在結(jié)合緩沖液中，用Annexin V/FITC 和PI 溶液染色；使用流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞百分比。

1.3.4 ERS 相關(guān)蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 采用Western blot 檢測小腸組織蛋白表達(dá)水平，樣本加入RIPA 裂解液（含1% 苯甲基磺酰氟）進(jìn)行裂解，孵育30 min后12 000 r/min 離心10 min，上清加入5×蛋白上樣緩沖液（還原型），渦旋后100 ℃× 5 min 水浴，降至室溫后保存于-20 ℃，BCA 蛋白測定法測定上清液中的蛋白含量。蛋白質(zhì)樣品在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中溶解，在0.1% Tween 20 的三聚氰胺緩沖鹽水中轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，5%的脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗滌3 次，再分別加入一抗PERK、GRP78 和CHOP以及Caspase-3、Bcl-2 和Bax，4 ℃過夜孵育，TBST洗滌3 次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育2 h，TBST 洗滌3 次，顯色液顯色，暗室下反應(yīng)20 min，最后用生物凝膠圖像分析系統(tǒng)定量分析蛋白表達(dá)水平，以β-actin 為內(nèi)參，以目的條帶與β-actin 條帶的比值作為蛋白相對表達(dá)量

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，樣本量由檢驗(yàn)效能分析結(jié)果決定，設(shè)定檢驗(yàn)功效為0.90，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小腸組織病理形態(tài)比較以及病理評分 對照組顯示正常組織病理學(xué)，腸組織未出現(xiàn)蘇木精和伊紅染色破壞性變化；燒傷組在燒傷后24 h，表現(xiàn)出以腸道為特征的腸道損傷水腫、絨毛完整性喪失和炎癥細(xì)胞浸潤。與燒傷組相比，干預(yù)組嚴(yán)重?zé)齻拇笫蠼M織學(xué)炎癥較少，見圖1。3 組大鼠的病變、炎癥、病變范圍、隱窩破壞評分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中干預(yù)組各評分低于燒傷組，高于對照組（P＜0.05），見表1。

圖1 小腸組織病理學(xué)HE 染色圖（×400）Fig.1 The HE staining map of rat myocardial histopathology（×400）

表1 小腸組織病理評分比較Tab.1 Comparison of histopathological scores of small intestine ±s，分

表1 小腸組織病理評分比較Tab.1 Comparison of histopathological scores of small intestine ±s，分

組別對照組燒傷組干預(yù)組F 值P 值只數(shù)10 10 10病變0.26±0.06 2.23±0.23 1.14±0.17 342.119＜0.001炎癥0.14±0.04 1.74±0.23 1.02±0.21 195.375＜0.001病變范圍0.52±0.16 3.46±0.47 2.33±0.32 189.117＜0.001隱窩破壞0.45±0.13 3.06±0.35 2.15±0.21 286.926＜0.001

2.2 小腸組織上皮細(xì)胞凋亡情況 流式細(xì)胞術(shù)檢測以及膜聯(lián)蛋白V-FITC/PI 雙重染色情況顯示，燒傷組的小腸組織上皮細(xì)胞凋亡情況較干預(yù)組嚴(yán)重，且細(xì)胞凋亡率明顯高于干預(yù)組（P＜0.05），見圖2、表2。

表2 細(xì)胞凋亡率比較Tab.2 Comparison of apoptosis rate ±s

表2 細(xì)胞凋亡率比較Tab.2 Comparison of apoptosis rate ±s

注：a 表示與對照組比較，P ＜0.05；b 表示與燒傷組比較，P ＜0.05

組別對照組燒傷組干預(yù)組F 值P 值只數(shù)10 10 10凋亡率（%）1.64±0.33 14.75±3.19a 9.16±2.52ab 78.046＜0.001

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果Fig.2 Flow cytometry results

2.3 小腸組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況 干預(yù)組的Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)量明顯高于對照組，低于燒傷組，而Bcl-2 高于燒傷組，低于對照組（P＜0.05），見表3、圖3。

圖3 不同實(shí)驗(yàn)組大鼠小腸組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.3 Expression of apoptosis related proteins in small intestine of rats in different experimental

表3 小腸組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況Tab.3 The expression of apoptosis related proteins in small intestine ±s

表3 小腸組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況Tab.3 The expression of apoptosis related proteins in small intestine ±s

注：a 表示與對照組比較，P ＜0.05；b 表示與燒傷組比較，P ＜0.05

組別對照組燒傷組干預(yù)組F 值P 值只數(shù)10 10 10 Caspase-3 1.05±0.23 4.24±0.57a 2.13±0.38ab 151.231＜0.001 Bcl-2 0.88±0.16 0.35±0.09a 0.66±0.12ab 44.220＜0.001 Bax 1.34±0.22 4.74±0.63a 3.68±0.52ab 126.863＜0.001

2.4 小腸組織ERS 相關(guān)蛋白表達(dá)情況 干預(yù)組的PERK、GRP 78、CHOP 蛋白表達(dá)量明顯高于對照組，低于燒傷組（P＜0.05），見表4、圖4。

圖4 不同實(shí)驗(yàn)組大鼠小腸組織ERS 相關(guān)蛋白表達(dá)情況Fig.4 Expression of ERS related proteins in small intestine of rats in different experimental groups

表4 小腸組織ERS 相關(guān)蛋白表達(dá)情況Tab.4 The expression of ERS related proteins in small intestine ±s

表4 小腸組織ERS 相關(guān)蛋白表達(dá)情況Tab.4 The expression of ERS related proteins in small intestine ±s

注：a 表示與對照組比較，P ＜0.05；b 表示與燒傷組比較，P ＜0.05

組別對照組損傷組干預(yù)組F 值P 值只數(shù)10 10 10 PERK 0.52±0.07 1.14±0.25a 0.85±0.16ab 31.043＜0.001 GRP78 0.55±0.09 1.28±0.27a 0.93±0.18ab 35.265＜0.001 CHOP 0.63±0.15 0.98±0.23a 0.77±0.12ab 10.367＜0.001

3 討論

嚴(yán)重?zé)齻梢灾苯踊蜷g接導(dǎo)致腸道致病菌的生長以及破壞腸道機(jī)械屏障，進(jìn)而引發(fā)腸道細(xì)菌移位或毒素大量吸收入血，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征、敗血癥及多器官功能障礙綜合征［7］。與此同時，凋亡和壞死的腸上皮細(xì)胞誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)，使得腸黏膜通透性增加，從而破壞腸道組織的機(jī)械屏障和免疫屏障。實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明腸道是多器官功能障礙綜合征的始動器官，對多器官功能障礙綜合征的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸起重要作用，同時腸道又是多器官功能障礙綜合征最先受累的器官［8］，因此，腸道保護(hù)在嚴(yán)重?zé)齻闹委熤芯哂兄匾饬x。馬錢苷屬環(huán)烯醚萜類糖苷，是山茱萸科植物山茱萸中的主要藥效成分之一，研究表明山茱萸具有多種生物活性，表現(xiàn)出抗炎、降血糖、抗腫瘤、抗心律失常、免疫調(diào)節(jié)等作用，目前被廣泛應(yīng)用于抗神經(jīng)退行性病變、抗血栓、抑制黑素、治療糖尿病等方面［9-10］。另外，研究發(fā)現(xiàn)［11］，馬錢苷還具有良好的抗氧化能力，能在體內(nèi)對抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多種細(xì)胞凋亡，而嚴(yán)重?zé)齻竽c道損傷與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，因此推測認(rèn)為馬錢苷在嚴(yán)重?zé)齻芯哂心c道組織保護(hù)作用。目前，馬錢苷尚未應(yīng)用于燒傷臨床治療，尚無馬錢苷對燒傷腸道損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究，因此本研究旨在探討馬錢苷對嚴(yán)重?zé)齻笫竽c道損傷的影響及其具體機(jī)制，從而為燒傷患者腸道保護(hù)依據(jù)提供指導(dǎo)。

越來越多的研究表明，腸道上皮細(xì)胞凋亡與嚴(yán)重?zé)齻箴つね暾云茐暮湍c道屏障功能受損有關(guān)，進(jìn)一步激活氧化應(yīng)激和炎癥，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征［12］。本次研究發(fā)現(xiàn)，燒傷大鼠預(yù)防性灌胃給予馬錢苷后，燒傷后24 h 的腸道損傷情況較燒傷組明顯改善（P＜0.05），同時采用流式細(xì)胞儀檢測小腸黏膜細(xì)胞增殖與凋亡情況，結(jié)果顯示干預(yù)組的凋亡率明顯低于燒傷組（P＜0.05），表明預(yù)防性灌胃給予馬錢苷可改善燒傷大鼠腸道細(xì)胞凋亡，減輕腸道損傷，從而發(fā)揮腸道黏膜保護(hù)作用。caspase-3、Bcl-2 和Bax 均是凋亡相關(guān)蛋白，其中Bax、caspase-3 促進(jìn)凋亡，而Bcl-2 可抑制細(xì)胞凋亡，有研究表明Bcl-2 和Bax 等凋亡蛋白在腸黏膜損傷時處于異常表達(dá)狀態(tài)，并參與腸上皮細(xì)胞凋亡的過程。本次研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)組大鼠的Bax、caspase-3 表達(dá)水平明顯低于燒傷組，而Bcl-2 高于燒傷組（P＜0.05），表明馬錢苷可通過調(diào)控凋亡蛋白表達(dá)而抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，從而減輕腸黏膜損傷。另外，惠毅等［13］通過給潰瘍性結(jié)腸炎大鼠灌胃烏梅丸，結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)烏梅丸可下調(diào)Bax 表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2 表達(dá)，從而抑制結(jié)腸上皮細(xì)胞的過度凋亡，促進(jìn)結(jié)腸上皮黏膜屏障的修復(fù)，結(jié)合本次研究證實(shí)調(diào)控腸道凋亡蛋白表達(dá)可發(fā)揮良好的腸道保護(hù)作用。

嚴(yán)重?zé)齻竽c黏膜屏障損害過程極其復(fù)雜，其中嚴(yán)重?zé)齻蟀l(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)、缺血缺氧性損害、細(xì)菌與內(nèi)毒素等均是腸道屏障功能損害的重要原因，研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬通路激活介導(dǎo)嚴(yán)重?zé)齻∈竽c黏膜屏障功能損害過程［14］。PERK、GRP78、CHOP 均是ERS 途徑相關(guān)因 子，GRP78 屬于熱休克蛋白家族成員，嚴(yán)重?zé)齻麜rGRP78 表達(dá)上調(diào)，并誘發(fā)ERS，進(jìn)而上調(diào)激活凋亡基因，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［15-16］。PERK 是發(fā)生ERS 時最先啟動的通路，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于應(yīng)激狀態(tài)時，GRP78迅速從PERK 上解離，同時PERK 通過自身磷酸化激活，進(jìn)而激活活化轉(zhuǎn)錄因子4，上調(diào)生長停滯及損傷基因（CHOP），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，CHOP 也是介導(dǎo)ERS 凋亡的關(guān)鍵蛋白［17-21］。本次研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腸道燒傷后ERS 相關(guān)蛋白均處于高表達(dá)狀態(tài)，經(jīng)馬錢苷預(yù)防性干預(yù)后，PERK、GRP78、CHOP 表達(dá)水平較燒傷組大鼠明顯降低（P＜0.05），表明馬錢苷可下調(diào)ERS 途徑，從而阻斷凋亡信號通路，抑制Bax、caspase-3 的表達(dá)，改善腸上皮細(xì)胞凋亡情況，故而干預(yù)組大鼠的小腸組織學(xué)炎癥較少，腸道損傷水腫、絨毛完整性喪失等病理學(xué)情況相對燒傷組較輕。此前研究發(fā)現(xiàn)［22］，馬錢苷可通過下調(diào)TLR4/NF-κB 信號通路而減輕燒傷引起的腸道炎癥和氧化應(yīng)激，且相關(guān)研究［23-24］表明馬錢苷可抑制氧化應(yīng)激、炎癥因子釋放，對血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，還能抑制糖基化的終末產(chǎn)物所致氧化反應(yīng)，改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而減輕炎癥反應(yīng)和細(xì)胞器損傷。結(jié)合本次研究進(jìn)一步表明馬錢苷可下調(diào)燒傷大鼠腸上皮細(xì)胞ERS 途徑，從而減輕腸道上皮細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腸道保護(hù)作用。此次研究仍存在不足之處，對于大鼠灌胃給藥7 d 后，于造模前3 組大鼠的胃腸道狀態(tài)是否存在差異尚不明確，需開展實(shí)驗(yàn)進(jìn)行討論。

綜上所述，馬錢苷可減輕燒傷大鼠腸上皮組織病理損害，保護(hù)腸黏膜結(jié)構(gòu)，其機(jī)制可能與抑制腸上皮細(xì)胞ERS 途徑以及減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。