動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測的方法驗證

郭 琳 孫秀菊 郭艷瓊 梁 海 王建軍 馬占山 何建東

（1包頭市農牧科學技術研究所，內蒙古包頭 014000；2包頭市農畜產品質量安全中心，內蒙古包頭 014000）

方法驗證是指實驗室通過核查，提供客觀、有效的證據證明滿足檢測方法規定的要求[1]。方法驗證是保證結果準確性和可靠性的前提和基礎，實驗室在引用和使用標準方法之前，應認真研究標準方法中的內容和要求，如人員、設備設施、場所環境等條件。此外，還應通過試驗驗證實驗室是否有執行該標準方法的技術能力[2-6]。

β-受體激動劑又稱“瘦肉精”，人如果食用含有β-受體激動劑殘留的動物組織，當殘留量達到一定程度時就會對人體造成毒副作用，甚至急性中毒。自1997年開始，我國就將近有20種β-受體激動劑列入養殖禁用名單。因此，為保障食品安全，對動物源性食品中β-受體激動劑殘留的準確檢測具有重大意義。本文以《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測 液相色譜-串聯質譜法》（農業部1025號公告-18-2008）為基礎，對特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、萊克多巴胺、噴布特羅、克侖特羅等7種化合物進行方法優化驗證，驗證主要內容包括線性范圍、方法檢出限、方法定量限、正確度、精密度。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器有液相色譜-串聯質譜儀（Agilent1260-6420）、恒溫水浴振蕩器、高速離心機、酸度計、渦旋振蕩器、全自動氮吹儀。

主要試劑有特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、萊克多巴胺、噴布特羅、克侖特羅標準品；乙酸乙酯、叔丁基甲醚、甲醇，均為色譜級；β-鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，2%甲酸水溶液，3%氨水甲醇溶液，0.2 mol/L乙酸銨緩沖液，0.1 mol/L高氯酸溶液，10 mol/L氫氧化鈉溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 前處理過程。稱取2.00 g肉樣于50 mL離心管中，加入8.0 mL 0.2 mol/L乙酸銨緩沖液（pH值=5.2）、40 μL β-鹽酸葡萄糖醛苷酶和芳基硫酸酯酶，渦旋混勻，于37℃下避光水浴振蕩16 h。取出冷卻至室溫之后，渦旋混勻，在10 000 r/min條件下高速離心10 min，然后將上清液轉移至另一個50 mL離心管中，加入5 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液，渦旋混勻，用高氯酸調節pH值至1.0±0.2，在10 000 r/min條件下高速離心10 min，將上清液轉移至另一個50 mL離心管中，用10 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至9.5±0.2，加15 mL乙酸乙酯，渦旋混勻，振蕩10 min，在5 000 r/min條件下離心5 min，移取上層有機相至另一個50 mL離心管內。在下層水相中加入10 mL叔丁基甲醚，渦旋混勻，并振蕩10 min，在5 000 r/min條件下離心5 min，合并有機相，50℃下氮氣吹干，用5 mL 2%甲酸溶液溶解，備用。

取全部備用液過經甲醇、水、2%甲酸溶液各3 mL活化的MCX固相萃取柱，再依次使用2%甲酸溶液、甲醇各3 mL淋洗，抽干，用2.5 mL 3%氨水甲醇洗脫，將洗脫液在50℃下氮氣吹干。殘余物用0.2 mL甲醇-0.1%甲酸溶液（10 mL+90 mL混合）溶解，渦旋混勻，15 000 r/min高速離心10 min后，經0.22 μm濾膜過濾后上機待測[7]。

1.2.2 儀器條件。色譜條件：色譜柱為Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm×3.5μm）；流動相 A 為 0.1%甲酸水，流動相B為0.1%甲酸甲醇；柱溫為30℃；進樣量為10 μL；流速 0.3 mL/min。 梯度洗脫程序：0 min，97.0%流動相 A，3.0%流動相 B；0.50 min，97.0%流動相 A，3.0%流動相 B；2.00 min，50.0%流動相 A，50.0%流動相 B；2.10 min，10.0%流動相 A，90.0%流動相 B；7.50 min，10.0%流動相 A，90.0%流動相 B；7.60 min，97.0%流動相 A，3.0%流動相 B；16.00 min，97.0%流動相A，3.0%流動相B。質譜：電噴霧離子源正離子掃描；多反應監測。干燥氣溫度300℃，流速13 L/min。

1.2.3 方法驗證過程。具體包括以下幾方面的內容。

（1）線性范圍。稱取2.00 g空白試樣，分別添加7種β-受體激動劑混標工作液，制得濃度為0、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/kg 的系列標準工作液，按照前述前處理過程進行處理，過0.22 μm濾膜備用。

（2）方法檢出限、定量限。以信噪比等于3的標液濃度作為檢出限，以信噪比等于10的標液濃度作為定量限，該標準方法中規定7種化合物檢出限為0.25 μg/kg、定量限為 0.5 μg/kg。 稱取 2.00 g 空白樣品，添加檢出限和定量限濃度水平目標化合物，按照上述前處理步驟處理后，備用，待上機檢測。

（3）正確度。采用加標回收方式驗證正確度。β-受體激動劑類是禁用藥，針對食品中的禁用物質，回收率應在方法測定低限、兩倍方法測定低限和十倍方法測定低限進行3個水平試驗[2]。根據方法中給出的檢出限和定量限，依次添加 0.25、0.50、2.50 μg/kg 3個水平濃度，進行加標回收試驗。

（4）精密度。準確稱取2.00 g空白試樣，分別添加7種β-受體激動劑混標工作液至加標量為標準曲線中間濃度，本試驗以添加量為0.5 μg/kg為例，按照前處理過程操作，上機平行測定6次，計算相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 色譜條件優化

在Eclipse Plus C18色譜柱上，對比了0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸甲醇作為流動相對分離效果的影響。結果表明，在Eclipse Plus C18色譜柱上，0.1%甲酸甲醇的分離度優于0.1%甲酸乙腈，0.1%甲酸水溶液的分離度優于純水。因此，選用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇作為流動相進行梯度洗脫。

2.2 質譜條件優化

母離子優化，即分別對每一種單標溶液進行全質量數掃描，得到化合物的準分子離子。子離子優化，即對其母離子進行電子轟擊，得到碰撞產生的子離子，選擇2個響應值比較高的子離子，與母離子組成2組特定離子對，作為該化合物的定量離子對和定性離子對。毛細管電壓和碰撞能量優化，即分別對7種目標化合物施加毛細管電壓70～160 V，以5 V為梯度進行優化，在最佳毛細管電壓條件下，對每一對離子對設置碰撞能量5～50 eV，以3 eV為梯度進行優化，分別得到7種目標化合物的最佳毛細管電壓和碰撞能量。目標化合物的定性離子、定量離子以及碰撞電壓和能量見表1。

表1 7種β-受體激動劑的毛細管電壓和碰撞能量

2.3 工作曲線及線性范圍

將處理好的系列標準溶液按照濃度由低到高的順序供液相色譜-串聯質譜測定，以各標準溶液的濃度為橫坐標、各標準物質定量離子色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線，如圖1～7所示。7種標準物質溶液的標準曲線相關系數滿足《實驗室質量控制規范食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）中相關系數不應低于0.99的要求[3]。

2.4 方法檢出限與定量限

由表2可知：7種目標化合物的檢出限信噪比（S/N）為 28.2～636.7，均大于 3；定量限信噪比（S/N）為62.7～2 972.1，均大于10。說明在現有條件下該方法的檢出限和定量限可以滿足標準方法中規定的檢出限 0.25 μg/kg 和定量限 0.5 μg/kg。

表2 方法檢出限、定量限數據

2.5 正確度

以空白樣品為本底，添加7種不同濃度β-受體激動劑，其回收率范圍為73.2%～102.4%，加標回收試驗結果見表3。滿足標準方法中的要求，即以空白添加標準校正，其回收率范圍為70%～120%。

表3 試樣加標回收率測定數據

2.6 精密度

由表4可知，在空白樣品中添加7種β-受體激動劑進行6次重復試驗，計算相對標準偏差結果為6.6%～11.4%，滿足標準方法中批內相對標準偏差應≤20%的要求。

表4 精密度測試數據

3 結論與討論

本文以《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜-串聯質譜法》（農業部1025號公告-18-2008）為基礎，以葡萄糖醛苷酶、芳基硫酸酯酶為酶解劑，用pH值5.2的乙酸-乙酸銨緩沖溶液進行提取，經高氯酸沉淀蛋白后，用氫氧化鈉調節pH值至9.5，再分別經乙酸乙酯和叔丁基甲醚萃取后，過MCX固相萃取柱凈化，Eclipse Plus C18色譜柱分離，以0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸甲醇為流動相，UPLCMS/MS上機測試，對特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、萊克多巴胺、噴布特羅、克侖特羅等7種化合物進行方法優化驗證。結果表明：特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、萊克多巴胺、噴布特羅、克侖特羅等7種目標化合物在0～2.5 μg/kg范圍內有良好的線性關系，相關系數達0.99以上，方法檢出限、定量限滿足方法中的要求，平均回收率73.2%～102.4%，相對標準偏差≤20%。本文建立了畜產品中特布他林、西馬特羅、沙丁胺醇、氯丙那林、萊克多巴胺、噴布特羅、克侖特羅等7種β-受體激動劑的液相色譜-串聯質譜檢測方法的驗證過程，證實了在現有的設備設施、人員、環境等條件下有能力正確運用本方法進行檢測。