建蘭種子無菌萌發技術研究

賴金莉 鄭 薇 羅素梅 郭崇炎 蔡繼鴻 劉小平* 季春峰

（1贛州市蔬菜花卉研究所，江西贛州 341413；2江西農業大學，江西南昌 330045）

建蘭（Cymbidium ensifolium）又稱劍蕙、四季蘭，是蘭屬地生蘭的一種，其株型飄逸、易于管理、花香濃郁，常被用作園林造景植物。建蘭作為蘭科植物的一大類群，其繁殖方式主要有分株繁殖和外植體離體培養2種，后來科學家通過試驗發現了一種可以獲得大量植株的方法——種子的非共生萌發，即種子無菌萌發。蘭科植物種子無菌萌發繁殖系數高、周期短，在短時間內可以獲得大量同品種蘭花的無菌芽，是蘭科植物最優的繁育方法[1]。因此，在建蘭大規模生產過程中，種子繁殖成為研究者研究的熱點之一。

余迪求等[2]以建蘭未成熟的種子為材料，以MS為基本培養基，對建蘭原球莖的發生進行了研究，結果發現，培養體系為MS+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA時，建蘭種子的原球莖發生率可達85.71%。這是建蘭最早的種子無菌萌發研究。近年來，隨著建蘭珍稀名品的不斷出現，建蘭在花卉市場上的熱度暴漲，關于其種子繁育技術的研究也逐漸增多。葉秀仙等[3]研究了基本培養基和植物激素2個關鍵因子對素心建蘭種子萌發、根狀莖增殖、分化等各培養階段的影響，提出了素心建蘭在各生長發育階段的最佳培養體系以及培養方法。陳春[4]以建蘭嶺南奇蝶自交成熟的果莢為研究對象，研究了外植體消毒時間、生長素濃度、分化培養基、有機添加物等4個因素對外植體污染率、根狀莖增殖、分化和生根壯苗等的影響，克服了使用莖尖培養污染率高的問題，且培養基中添加0.5～3.0 mg/L NAA及0.5～1.5 mg/L IBA，可大大提高根狀莖的增殖系數。此外，陳緒盛等[5]、唐鳳鸞等[6]也對建蘭的非共生萌發進行了研究，獲得了較好的試驗成果。目前，關于建蘭種子無菌萌發的研究較多，但是都局限于市場前景較好的品種，鮮有對鄉土品種的報道。本研究以贛南地區野生建蘭的成熟蒴果為試驗材料，采用組織培養的方法，對其種子無菌萌發技術進行了研究，以探索最適合建蘭種子無菌萌發的培養體系，為本地建蘭工廠化、規?；a及新品種培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為野生建蘭成熟但未開裂的果莢，于2020年7月采自上猶五指峰和崇義齊云山。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒。①流水沖洗。取建蘭尚未開裂的成熟蒴果，用剪刀剪去過長的果柄，用清水洗凈果莢表面的灰塵，放于燒杯中，用流水沖洗1 h。②初步消毒。用70%乙醇浸泡5 min進行初步消毒后，轉入超凈工作臺。然后用無菌水沖洗果莢表面的乙醇，沖洗2遍。③氯化汞消毒。用氯化汞消毒液浸泡5 min后，用無菌水沖洗3～5遍。

1.2.2 種子萌發培養基的配制。采用固體培養基，以1/2 MS為基本培養基，分別設置如下6個處理，即1/2 MS+8 g/L 瓊脂粉+30 g/L 蔗糖（A）、1/2 MS+8 g/L瓊脂粉+30 g/L蔗糖+2.0 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-BA（B）、1/2 MS+8 g/L 瓊脂粉+60 g/L 蔗糖（C）、1/2 MS+8 g/L瓊脂粉+60 g/L蔗糖+2.0 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-BA（D）、1/2 MS+8 g/L 瓊脂粉+90 g/L 蔗糖（E）、1/2 MS+8 g/L瓊脂粉+90 g/L蔗糖+2.0 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-BA（F）。以上培養基均添加1g/L活性炭，pH值5.8。

1.2.3 無菌播種。外植體消毒結束后，在酒精燈旁，用酒精燈灼燒過的解剖刀把建蘭蒴果從中間剖開，將種子均勻撒在培養基上。播種后在黑暗條件下培養至有種子開始萌發，再放入光照培養箱，培養溫度為（25±2）℃，光照強度為2 000 lx，相對濕度為 75%。

1.2.4 生根壯苗培養。以1/2 MS為基本培養基，分別加 0、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/L NAA。 以上培養基均添加0.4 mg/L 6-BA、30 g/L蔗糖、50 g/L瓊脂、1.0 g/L活性炭，pH值5.4。以650 mL組培瓶為培養容器，每瓶培養基用量100 mL，每瓶接種20個幼芽，每個NAA濃度接種4瓶，培養溫度（25±3）℃，光照強度 2 000～2 500 lx。

1.3 萌發指標計算與統計方法

播種后每隔30 d，用體視顯微鏡觀察每個平板上種子的萌發狀態，并統計種子發育的數量及階段，計算各階段發育所需時間。將建蘭初期萌發過程分為 A、B、C、D、E等 5個階段：A 階段，種胚未萌動；B階段，種胚膨大但未突破種皮；C階段，原球莖突破種皮；D階段，根狀莖突破種皮且變成綠色；E階段，根狀莖出現分枝現象[7]。無菌播種培養300 d后統計萌發結果，生根壯苗試驗接種90 d后統計生根率，計算公式如下：

式中，A、B、C、D、E 分別為不同階段種子數量。

1.4 數據統計分析

采用Excel 2007進行數據整理，采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對建蘭種子萌發的影響

植物激素的有無以及蔗糖濃度的高低對建蘭種子萌發均有顯著影響。在不添加植物激素的條件下，建蘭種子也可萌發，但萌發率較低，如表1所示，處理A、C、E未添加 6-BA、NAA，萌發率分別為 46.43%、65.43%、27.68%；添加 6-BA 與 NAA 后，處理 B、D、F萌發率分別為74.04%、86.27%、57.94%，分別較處理A、C、E增加了27.61個百分點、20.84個百分點和30.26個百分點。在蔗糖濃度為60 g/L時，種子萌發率最高達86.27%，顯著高于蔗糖濃度為30 g/L和90 g/L的處理；種子的萌發指數最高可達23.76，顯著高于其他處理。可見適宜的蔗糖濃度可以促進種子萌發，蔗糖濃度過高或者過低都會在一定程度上抑制建蘭種子萌發。綜上可知，添加外源植物生長調節劑6-BA、NAA以及適宜濃度的蔗糖能顯著提高建蘭種子的萌發率。本試驗篩選出建蘭種子無菌萌發最適培養基為1/2 MS+8 g/L瓊脂粉+60 g/L蔗糖+2.0 mg/L NAA+0.4 mg/L 6-BA+1 g/L活性炭（處理D），為后期建蘭種苗批量繁育奠定了基礎。

表1 不同培養基對建蘭種子萌發的影響

2.2 建蘭種子萌發過程觀察

用高清體視顯微鏡觀察種子在處理D培養基中的萌發過程，建蘭種子呈紡錘狀，外層由透明種皮包裹，見圖1（a）。在萌發培養基上經過120 d的培養，觀察到種子開始萌發。發育至圖1（c）的種子，突破種皮，開始萌動，并出現綠色的原球莖。取出10個發育至圖1（b）的種子進行重點觀察，結果發現，由圖 1（b）發育至圖1（c）平均約需40 d，其中用時最長 68 d、最短15 d，此階段原球莖體積快速增大，顏色呈深綠色。

由圖 1（c）發育至圖 1（d）平均約需 43 d，其中用時最長64 d、最短34 d，此發育階段原球莖長度和體積快速增長，顏色加深。 圖 1（d）發育至圖 1（e）平均約需 47 d，其中用時最長86 d、最短32 d，繼續培養形成綠色的原球莖，原球莖不斷伸長繼而形成根狀莖，并出現分枝現象，此時根狀莖完全脫離種皮。在萌發過程中，還有一些不能正常萌發的種子，受種胚發育不良、營養缺乏等影響，種子生長發育緩慢，最后完全褐化死亡，見圖 1（f）。

2.3 NAA對建蘭生根壯苗培養的影響

由表2可知，在生根培養基中添加生長素NAA后，可以明顯提高建蘭無菌芽的生根率。NAA濃度為 0.4、0.8、1.2、1.6 mg/L 時，接種 90 d 的平均生根率分別為53.39%、72.04%、60.60%、48.03%。由此可知，在NAA濃度為0.8 mg/L時，生根率最高，在90 d時最高可達80.50%。綜上可知，在生根培養基中添加0.8 mg/L NAA時，建蘭的生根效果最好。

表2 NAA濃度對生根的影響

3 結論與討論

蘭科植物的一個蒴果內含有數萬粒甚至百萬粒種子[8]，且種子非常細小，呈粉末狀。受種胚發育不良、無子葉和胚乳、營養物質較少、種皮致密、透氣性差等因素影響，蘭科植物的種子在自然條件下很難萌發[9]。傳統的分株繁殖由于繁殖周期長、繁殖率低，且存在種性退化和攜帶病毒的問題，不能滿足市場對優良品系的需求[7]。蘭科植物種子數量多、易獲得，是進行組織培養的重要材料。因此，種子無菌萌發成為相關研究的熱點之一，如陳丹丹[10]、席會鵬等[11]、鄭洲翔等[12]在無菌播種的條件下，探索了蘭科植物種子萌發的最適培養條件。

培養基是植物組織培養的關鍵，它為植物的離體培養提供了生長發育所需的各種營養元素。蔗糖作為能源物質在組織培養過程中起著至關重要的作用，相關研究表明，2%蔗糖最有利于蘭花原球莖的生長，2%～3%蔗糖有利于芽的形成，5%蔗糖有利于根的生長和分化[13]。植物生長調節劑作為組織培養過程中另一個重要因素，常用的有生長素類和細胞分裂素類，包括NAA、6-BA和IBA等，一般組培苗在不同生長階段對生長素和細胞分裂素的需求也不同。

本研究以建蘭種子為試驗材料，探索了蔗糖濃度及植物生長調節劑對建蘭種子萌發及生根的影響。結果表明，60 g/L蔗糖與0.4 mg/L 6-BA、2 mg/L NAA組合，建蘭種子萌發率最高；在生根壯苗試驗中，當0.8 mg/L NAA與0.4 mg/L 6-BA組合時，生根率最高，在90 d時最高可達80.50%。此外，本研究還觀察了建蘭種子無菌萌發的過程，在播種后到根狀莖分枝大約要經歷250 d，后續生根壯苗還需要一段較長的時間。對建蘭種子萌發過程的觀測可加深對建蘭種子萌發研究的理解。