食品中菌落總數檢驗方法驗證結果分析

◎ 馬 芳，王麗杰

（河南中測技術檢測服務有限公司，河南 鄭州 450000）

我國最新國家標準方法《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2—2016）[1]規定菌落總數是指食品檢樣經過處理，在一定條件下（如培養基、培養溫度和培養時間等）培養后，所得1 g（或1 mL）檢樣中形成的微生物菌落總數。

食品中菌落總數測定是用來判定食品被細菌污染的程度的標志，它反映食品在生產過程中是否符合衛生標準，在一定程度上標志著食品衛生質量的優劣[2-3]。通過測定菌落總數，可以觀察其在食品中的生長繁殖變化，為市場監督管理評價，提供重要依據。所以，測定食品中的菌落總數意義重大。目前，國內食品微生物實驗室均按照國家標準GB 4789.2—2016來檢測菌落總數。在日常檢測時，因受多種因素的干擾，影響到檢測數據及結論的準確性、可靠性。

2018年9月1日實施《檢測和校準實驗室能力認可準則》（CNAS—CL01：2018）[4]。新版準則中對方法驗證的實施從崗位職責的設置、人員能力的要求、人員授權，到技術能力的驗證提出了明確要求。然而很多實驗室在實施方法驗證過程中，由于對準則理解不透徹，對方法驗證概念及技術操作的理解不全面，導致其在實施方法驗證過程中存在很多不足，因而不能準確完成方法驗證，無法滿足認可準則的要求或檢測標準方法的要求[5]。因此需對檢測方法進行驗證，排除干擾因素，提供客觀數據，以證明實驗室可以準確使用該檢測方法，確保所用方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品和標準菌株

取3種不同基質樣品：大辣棒（調味面制品）、蛋白固體飲料、多維三合一核桃粉（經滅菌處理，樣品空白默認為0），分別標記為Y1、Y2、Y3；大腸埃希氏菌（ATCC 29522）作為人工污染菌株，購買于山東拓普生物工程有限公司（附有質量檢測報告），菌種驗收合格。

1.1.2 培養基及試劑

平板計數瓊脂（Plate Count Agar）（青島海博）、含225 mL的0.85%生理鹽水均質袋（青島海博）。

按照（GB 4789.28—2013）表E.1對平板計數瓊脂進行技術性驗收，大腸埃希氏菌（ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、枯草芽孢桿菌（ATCC6633）半定量值G分別為12、10、10，滿足G≥6，培養基技術驗收合格，滿足培養基使用需求。

1.2 儀器與設備

YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；BSC-1500IIA2-X 生物安全柜（濟南鑫貝西生物）；SPX-250B-Z 生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；HN-08拍打式無菌均質器（上海汗諾儀器有限公司）。

儀器設備校準機構：方圓檢測認證有限公司，具有校準、檢測資質；儀器設備校準、檢測結果符合使用標準要求。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

（1）菌液的制備。挑取大腸埃希氏菌標準菌株（ATCC29522）磁珠于10 mL腦心浸出液（Brain Heart Infusion，BHI）中，36 ℃培養18～24 h，待用。

（2）稀釋液對照組制備。取10 mL的2.4.1中菌液加入90 mL生理鹽水中，混勻，進行10倍系列稀釋。

（3）樣品驗證組制備。取25 g樣品Y1、Y2、Y3加入225 mL生理鹽水中，均質混勻。

1.3.2 稀釋液對照組

分別取1.3.1中的10倍系列稀釋度中的10-3～10-6樣液各1 mL，注入兩個平皿中，同時移取稀釋液作空白對照。及時將冷卻至46 ℃的PCA培養基15～20 mL傾注平皿，并呈8字形晃動平皿使樣液混合均勻。置水平臺面待培養基完全凝固，倒置放入36 ℃培養箱中進行培養，重復測定6次數據，測定結果見表1。

1.3.3 樣品驗證組

分別取1.3.1中的10倍系列稀釋度中的10-3～10-6樣液各1 mL，注入兩個平皿中，再在平皿中注入1.3.1中10倍系列稀釋度中的10-3～10-6樣液各1 mL，每個稀釋度注入兩個平皿，同時移取稀釋液作空白對照。及時將冷卻至46 ℃的PCA培養基15～20 mL傾注平皿，并呈8字形晃動平皿使樣液混合均勻。置水平臺面待培養基完全凝固，倒置放入36 ℃培養箱中進行培養。重復測定6次數據，測定結果見表1。

2 結果與分析

2.1 菌落數測定

由表1可知，選取菌落數在30～300的平板，計算平板菌落數平均值，依據GB 4789.2—2016中7.1.2進行計算。對照組和樣品組Y1、Y2、Y3稀釋度10-5與10-6呈現梯度稀釋倍數關系，符合相關要求。

表1 不同稀釋度的樣品菌落數表（單位：CFU·g-1）

2.2 環境條件

環境監測數據結果如表2。實驗室為萬級無菌室，設有恒溫恒濕設施，結果表明，符合《實驗室質量控制規范 食品微生物檢測》（GB/T 27405—2008）的標準要求。

表2 無菌間環境監測數據表

2.3 估計偏差

樣品驗證組與對照組估計偏差R計算公式為

式中：R為估計偏差；A為對照組菌落數，CFU·g-1；B為樣品驗證組菌落數，CFU·g-1。

計算R1、R2、R3的估計偏差分別為0.017 7、0.049 2、0.064 5，以上R均＜0.5，符合RB/T 033—2020規定偏差要求。

2.4 精密度

按全程序對稀釋對照組和樣品驗證組Y1、Y2、Y3平行測定6次，測定及統計結果見表1，精密度驗證結果見表3。以上結果表明，稀釋液對照組和樣品驗證組Y1、Y2、Y3相對偏差均小于10%，滿足實驗要求。

表3 精密度驗證結果表

3 結論

本實驗室人員、儀器設備設施、培養基、試劑、菌種和環境條件等實驗條件均滿足《檢測和校準實驗室能力認可準則》（CNAS—CL01：2018）要求。通過對不同基質樣品人工污染，進行菌落總數的檢測，驗證結果表明，估計偏差、精密度、梯度線性等滿足標準方法要求；標準方法可操作性強，滿足實驗要求。驗證結論：本檢測機構有能力滿足開展《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB 4789.2—2016）檢測的各項要求，可以開展此項檢測工作。