寒冷環境下魚類抗寒抗凍的細胞內在機制探討

時昕曄

（南京師范大學海洋科學與工程學院，南京 210023）

在動物的進化進程中，相對低級的原核生物以及相對高級的動植物均逐漸進化出較多應對生存的適應性機制，以益于自身在相對惡劣的生存環境中存活乃至繁衍生息。例如南極魚類可以長時期存活于零下的水域環境中，說明南極魚類進化出了能抵御低水溫的生理策略來適應相對嚴峻的自然環境［1］。自然界的生物體一直處于環境因素的作用下，而自然環境中的低溫因素是對其有影響力的一項重要因素，主要表現于對個體的生長、生物體的自體溫度調節、繁育后代等的一系列生命過程中。難以生長、存活與繁衍的低溫環境會干擾生物體的內在機制，譬如會引發蛋白質的異常折疊、抑制胞內酶的活性表達、致使細胞內的細胞膜流動性變弱以及細胞表面冰晶的形成等。因此，探究低溫適應性的相關機制有利于掌握生物體適應多變環境的特性。

溫度作為重要的生態因子之一，在水產動物養殖中發揮重要的作用。已有大量水產物種例如南美白對蝦、雜色鮑、硬骨魚綱等水產養殖品種的相關低溫馴化以及冷應激的研究，注重分析低溫對諸如此類水產動物的生理和生化影響，并鑒定抗凍的有關基因等［2］。低溫會影響水產養殖魚類的自然生長發育，過低的水域溫度致使養殖魚類大批死亡，造成水產養殖產業的巨大經濟損失。低溫會致使魚類的覓食量減少、基礎代謝率降低、限制抗體的生成和免疫功能，降低其生長速率以及孵育率，妨礙魚類的生理、生長與繁殖等多方面的正常功能發揮［3］。基因家族是指來源于同一個祖先，由1個基因通過基因重復而產生2個或更多的拷貝而構成的一組基因。它們在結構和功能上具有明顯的相似性，編碼相似的蛋白質產物。同一基因家族中存在的不同亞型的功能作用及其表達的位置都會有所差異，對于基因家族的研究有助于依據其具體功能和目標性狀縮小研究范圍。AKT/PI3K信號通路主要與細胞的增殖發育以及免疫功能有關，在低溫脅迫中對抑制細胞凋亡起關鍵作用，其中的關鍵基因AKT、PI3K、GSK3相繼在斑馬魚、黃顙魚、牙鲆中都有研究，與抗凍及AKT/PI3K信號通路相關的基因CK在鯉魚和斑馬魚中都有較全面的研究［4，5］。

本研究為黑鯛抗凍關鍵基因家族鑒定，基于已有的基因家族成員，從黑鯛的基因組中篩選了AKT、CK的基因家族成員，對其分子質量、等電點、motif結構、保守結構域等基本信息進行分析，與近緣物種構建系統進化樹，有助于進一步了解魚類相關基因的結構及功能，為后續研究PI3K/AKT信號通路及其中的關鍵基因奠定基礎。

1 研究方法

1.1 研究樣本的選擇

從已有的黑鯛基因組及注釋（https：//ftp.cngb.org/pub/gigadb/pub/10.5524/100001_1）數據中比對篩選獲得目的基因的基因家族氨基酸序列。選取黑鯛的近緣物種金頭鯛、大黃魚的目的基因序列，以常見的模式生物斑馬魚、人類、小鼠的目的基因序列作參考。相關的氨基酸序列來源于Ensembl數據庫（http：//www.ensembl.org）和NCBI數 據 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。

1.2 基因家族序列的獲得

使用TBtools軟件從黑鯛基因組數據中篩選出目的基因序列，并基于其保守結構域和親緣關系對篩選的基因進行分類和命名。分析步驟如下。

1）黑鯛基因組數據中心的蛋白質序列的提取：基于基因組數據的注釋信息，使用TBtools軟件提取CDS序列，將其翻譯為氨基酸序列，并簡化其序列ID。

2）雙向比對獲取備選的序列：使用Blast Wrapper功能，以已經獲取的序列作為查詢序列，比對獲得黑鯛中可能的序列，作為備選。上傳至NCBI使用Swissprot數據庫進行比對，下載獲取的備選序列信息，查看其基本特征，進行初步篩選。

3）基于保守結構域進行進一步篩選：將備選基因的氨基酸序列上傳至NCBI數據庫的在線結構域分 析 網 頁（http：//www.ncbi.nlm.nih.gw/structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi），下載得到備選序列的保守結構域，并基于保守結構域對備選序列進行2次篩選，確認基因家族的成員。

4）根據保守結構域的類型、系統進化樹的聚類情況，對相應的序列進行分類和命名，含有多個直系同源基因的基因，在后面加數字以區分基因的不同拷貝。

1.3 氨基酸序列基本信息分析

借助網絡在線工具，分析獲取的目的基因序列的理化性質及保守結構域等基本信息。

1）使用Compute pI/Mw工具（http：//web.expasy.org/compute_pi/）計算氨基酸序列的等電點（PI）和分子質量（MW）。

2）使 用MEME 4.12.0（http：//meme-suite.org/tools/meme）在線程序，對所鑒定的序列中Motifs的保守性進行預測分析。

3）使用NCBI保守結構域預測軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）分析預測AKT基因的domain結構域的保守性。

4）借助TBtools本地軟件對分析結果進行可視化。

1.4 基因家族成員的進化分析

利用ClustalX對鑒定的基因家族成員序列和其他選定物種的序列進行比對，獲取的結果使用MEGA 7軟件應用最大似然法（ML）構建系統進化樹。借助MEGA 7軟件分析最合適的進化模型，自展值設為1 000。

2 結果與分析

將從Ensembl數據庫下載的斑馬魚、大黃魚、金頭鯛、人類、小鼠的AKT基因家族作為參考序列，以黑鯛基因組數據為基礎，篩選出AKT、CK基因家族序列，并對其進行基本的分析。

2.1 AKT基因家族序列的鑒定和基本信息

從黑鯛基因組中篩選出了的3個不同亞型的AKT基因，分別為akt1、akt2、akt3（表1）。其長度分別為619、481、555 bp，分子質量分別為70.5、55.9、64.4 kDa。理論等電點為5～6，說明序列偏酸性。通過對序列的蛋白序列的保守基序進行分析（圖1），發現AKT基因家族序列均含有10個保守基序，數目和順序基本一致，表明AKT基因家族蛋白保守性較高。對序列的蛋白質結構進行分析，AKT1含有STKc_PKB_alpha結構域，AKT2、AKT3含有PKc結構域，三者均含有PH_PKB結構域。

圖1 黑鯛AKT基因家族成員保守基序motif和結構域分析

表1 AKT基因家族序列基本信息

自NCBI數據庫和Ensembl數據庫下載金頭鯛、大黃魚、虹鱒、尼羅羅非魚、大西洋鮭、斑馬魚、雞、人類、小鼠、多疣壁虎的AKT序列，并與黑鯛的AKT序列構建進化樹（圖2）。從進化樹中可以看出，魚類的AKT序列單獨聚為一支，其中AKT1、AKT3和同為鯛科的金頭鯛親緣關系最近，二者又和同為鱸形目的大黃魚聚為一支。AKT2雖然和魚類聚為一支，但是和其他魚類的親緣關系都較遠。

圖2 黑鯛和其他物種AKT基因家族進化樹

2.2 CK基因家族序列的鑒定和基本信息

CK的2個同功酶在在黑鯛基因組中均鑒定出來（表2），分別為mck和bck，序列長度均為382 bp，長度一致。mck理論等電點為6.44，bck為5.30，均偏酸性；分子質量基本一致，為42.9 kDa。黑鯛CK基因家族成員保守基序motif和結構域分析如圖3所示，二者的motif數目及順序均一致，具有較高的保守型，含有1個creatine kinase結構域。

圖3 黑鯛CK基因家族成員保守基序motif和結構域分析

表2 CK基因家族成序列基本信息

將黑鯛的2個CK序列與獲取的金頭鯛、大黃魚、虹鱒、尼羅羅非魚、大西洋鮭、青鳉、斑馬魚、人類、小鼠的CK序列進行比對，構建基因家族進化樹（圖4）。其中哺乳動物的mck和bck均與魚類的bck親緣關系較近，但是和魚類相比，又自成一支。在mck中，黑鯛與金頭鯛具有較緊密的親緣關系，二者又與其他物種聚為一類，除了大西洋鮭和斑馬魚；而bck中，黑鯛與大黃魚親緣關系最近，相比于其他魚類又單獨聚為另一支。

圖4 黑鯛和其他物種CK基因家族進化樹

3 討論

3.1 低溫下的分子、細胞與組織受損

魚類面臨急性的低溫脅迫會出現分子、細胞與組織等較多水平的受損表現。溫度對細胞內核酸和蛋白質等的組分結構及功能狀態具有決定性的作用力。在生理溫度下，細胞能夠表達與其環境的溫度相適應的酶與蛋白，構成益于實現一系列的生物學功能的細胞內穩定狀態［6］。當魚體面臨低溫脅迫情況時，細胞內的核酸和蛋白質等分子會錯誤折疊、組裝，降低其活性。低溫脅迫也可以誘發產生活性氧（ROS），引起DNA和蛋白質的氧化受損。在細胞層面，低溫刺激能夠抑制生物膜（細胞膜與細胞器膜）的流動性，使膜的結構發生改變，降低膜和膜結合蛋白的原有功能。在低溫下，魚類生成能量的速率受到影響，引發細胞的能量供應短缺。低溫也會干擾微管蛋白的多聚化過程，使其穩定性下降，使細胞骨架受損，細胞形態發生改變。而且，低溫能激發線粒體的超極化，并且提升溶酶體膜的通透性。魚類的低溫暴露還能造成脂肪的過氧化現象發生，使細胞衰亡通路被激發［7］。

3.2 魚類的低溫應激和相應的調控機制

3.2.1 感知與傳遞低溫刺激信號 魚體會對低溫刺激形成應激反應，逐步形成新的生理、生化與代謝穩態來提升抗寒抗凍能力，此過程為低溫適應。魚類的機體和細胞需要感受到水域低溫的刺激，并將此信號向細胞核傳遞，啟動低溫應激的反應。在魚類感知低溫信號中，真核細胞對低溫信息的傳遞主要借助鈣離子（Ca2+）信號傳遞系統，低溫刺激會激發細胞外Ca2+的內流，逐漸激活有關的轉錄因子以及蛋白激酶。離體培養的昆蟲研究中，利用Ca2+信號使組織感知低溫的刺激并且激活“快速低溫強化（RCH）”機制，借助特異性抑制劑對Ca2+的內流進行抑制，發現鈣調蛋白的激活作用和鈣調蛋白依賴激酶Ⅱ的活性均可以去除RCH的抗寒效應［8］。魚類的中樞神經也在對低溫刺激信號的感知和低溫信號的傳遞過程中發揮一定作用。例如鯉，其下丘腦的視前區在接收到降溫的刺激后在半分鐘之內就可以被激活，其鄰近的內分泌神經元在被激活之后能夠產生促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH），激發下游的生理反應。通過遺傳研究得出線蟲類的GLR-3基因也擁有低溫感受器的作用，該基因可以對谷氨酸受體進行編碼，其在斑馬魚的同源基因gluk2中也擁有低溫信號的傳遞作用［9］。進行體外培養的組織與細胞也可以感知低溫的刺激以及對低溫信號進行傳遞并且啟動機體的低溫應激，反映出不依賴神經以及細胞的自主低溫感受器為真實存在。關于魚類的低溫感受器尚需要深入的研究和鑒定，Ca2+信號系統在魚類的低溫信號傳遞期間功效也需要深入的研究佐證。

3.2.2 低溫下的轉錄及有關調控機制 細胞在收到低溫的刺激信號后，借助對基因的表達而實現精準調控，逐步建立起胞內新穩態，對低溫應激下的分子受損進行修復作用，將嚴重受損的細胞清除體外，提升機體的抗寒抗凍能力。在遇到低溫刺激時，魚類的中樞神經會接收到來自低溫的刺激，離子通道（低溫感受器）因此被激活，使Ca2+進入細胞內部。胞內游離狀態的Ca2+含量升高，有關的激酶也被激活，使特定的轉錄因子發生磷酸化與活化；活化后的轉錄因子進入到細胞核內，并且對下游基因的轉錄實現激活作用，此為低溫信號的傳遞過程［10］。

近年以來，借助基因芯片、small RNA-seq等技術對較多種類的魚展開了研究，并對調控低溫的基因等進行了篩選［11］。研究的種類包括模式魚、經濟魚、暖水性魚、冷水性魚等；低溫處理的手段有急性或者慢性暴露；刺激的處理程度包括溫和、非致死、致死的低溫暴露等；樣品的組織同樣具有豐富的來源。盡管種類的不同對低溫刺激的反應性差異較大，然而低溫應激反應的相關核心基因得到了鑒定，例如RNA結合蛋白cirbp、硬脂酰輔酶A去飽和酶（scd）等，此類的基因在較多的情況下均可以被低溫刺激誘導而進行表達。通過富集分析低溫響應基因（CRG）的基因本體（GO）和信號通路得出，RNA的剪接、轉錄、生物鐘的節律性、蛋白質的分解代謝等是最具核心的受低溫調節與控制的生物學過程，FoxO信號通路在魚類的抗寒抗凍能力形成期間發揮著關鍵調控作用。不同組織細胞對低溫刺激的反應性既有相同之處，又存在較大的特異性。某些組織的低溫應激反應和其功能存在緊密的關系，例如肝臟的CRG著重在能量和脂肪酸的代謝中發揮作用，肌肉的CRG關鍵在能量代謝和肌肉的萎縮中起作用，鰓的CRG主要在離子調控中起作用［12］。

3.2.3 低溫下的蛋白質組學 低溫刺激下，細胞率先翻譯含有特定序列的mRNA，從而對細胞的蛋白質組成展開調節；低溫還刺激蛋白質的乙酰化、磷酸化等反應的翻譯后修飾作用，其會出現化學性質的變化，益于在低溫下進行功能發揮。立足于質譜分析的蛋白質組學顯著激發了低溫調控的蛋白質和其翻譯后修飾的鑒定工作。在蝦虎魚的相關低溫應激研究中，從其心臟中鑒定到37個受溫度作用的蛋白質，此類的蛋白質在能量的代謝、線粒體的調控等生物學的過程中起著關鍵作用；在低溫適應之后，其心臟肌酐激酶的表達明顯提升，反映出磷酸肌酐的能量系統在9℃低溫應激下對心臟的功能發揮起著較大效用［13］。一項研究在暗紋東方鲀的肝臟中鑒定出160個受低溫影響的蛋白質，低溫激發的谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、RNA結合蛋白（CIRBP）等為核心的低溫誘導蛋白種類；此類的蛋白質富集的過程例如氧化應激以及信號傳遞等；對金頭鯛的低溫應激相關研究中，其肝臟的蛋白質組學分析得出，低溫調控相關蛋白著重在分解代謝中發揮作用［14］。

3.2.4 低溫下的“多組學”機體與細胞的抗寒抗凍能力由類型不同的生物分子的相互作用網絡共同決定。所以，實施“多組學”的系統分析有利于相對完整獲得和抗寒有關的效應基因，更完整地解析魚類的低溫適應以及抗寒抗凍能力形成的細胞內分子機制。在關于暗紋東方鲀的肝臟“多組學”（轉錄、蛋白質與代謝）研究中，可見36個共表達的差異表達基因（DEG）-差異表達蛋白（DEP）對，19個變化方向截然相反的DEGDEP對；其中有17個DEM和共表達的14個DEG-DEP對均在脂肪酸的代謝、膜轉運等的過程中起作用［15］。

3.2.5 表觀遺傳修飾的功效 低溫可刺激組蛋白出現乙酰化等反應的翻譯后修飾作用，基因組DNA出現甲基化以及去甲基化等。諸多的研究分析魚類的“熱印記”現象，也即發育早期的溫度環境對魚類應對溫度脅迫時反應的作用力。斑馬魚的胚胎期培養溫度刺激會對成魚在低溫應激下的游泳能力、類型不同的肌纖維構成與肌肉對低溫應激的轉錄形成影響；金頭鯛的胚胎期和仔魚期應對的“熱印記”會對成魚在低溫脅迫的反應形成影響；在低溫培養后，金頭鯛的血漿皮質內的鈉離子（Na+）、鉀離子（K+）和葡萄糖濃度、骨骼的代謝均會受到早期發育時培養溫度的明顯影響；研究還證實胚胎期的培養溫度會對塞內加爾鰨和大西洋鱈的幼魚期較多組織中的miRNA表達形成影響［16］。

3.3 魚類抗寒抗凍重要基因研究

3.3.1AKT、CK基因 對AKT信號通路的關鍵基因進行基因家族的篩選，并對序列進行基本分析。研究表明，這些基因并不只在AKT信號通路發揮作用，其具有多方面的調控功能。但是在低溫脅迫下，魚類的主要致死原因是細胞在低溫下凋亡，因此本研究重點關注目的基因在細胞的增殖、生長及凋亡相關的功能。

黑鯛AKT基因共3個亞型，分別為akt1、akt2、akt3，三者均含有PH_PKB結構域，另外AKT1含有STKc_PKB_alpha結構域，AKT2、AKT3含有PKc結構域。說明其激酶催化結構域有一定不同，表明其功能上有一定的不同。已有研究表明，akt主要與斑馬魚的生長有關，其中akt1和akt2都和脂肪的代謝有關［17］。

在黑鯛中鑒定出肌型肌酸激酶和腦型肌酸激酶2種同功酶，二者長度和分子質量基本一致，且都包含creatine kinase結構域。在本研究中，由于魚類在低溫脅迫中，肌肉會出現顫抖等行為，所以主要以mck為主。

3.3.2 其他基因 應激顆粒實為生物體內的細胞面對外界環境的惡劣變化時產生的無膜包裹的一種細胞顆粒物質，大小0.10～2.00μm，是由未經翻譯環節的信使核苷酸蛋白復合體（mRNPs）積聚而形成，其組裝可被環境壓力進行激發，例如：氧化、高滲透壓或者病毒的感染等，此種環境壓力排除X-射線的作用。應激顆粒對其的mRNA成分擁有選擇性，其含有一部分的編碼管家基因的轉錄本，然而需要排除壓力誘導下編碼的基因。在培養細胞和完整組織內均可以發現應激顆粒［18］。

南極海洋的大環境影響下，較多的魚種面臨巨大的生存挑戰，部分逐步進化出了抗寒抗凍的內在機制。盡管北極熊棲息生存于北極的海域，以及部分的南極海域魚種，其體內均可以合成Ⅲ型抗凍蛋白（AFPⅢ）。研究指出，AFPⅢ的抗凍活性和其分子量間有正相關關系，南極魚體內原有的14 kD的AFPⅢ抗凍活性為7 kD蛋白的近2倍，而ld4分子源自于南極魚的多聚AFPⅢ基因中的經過克隆所得的AFPⅢ蛋白四聚體，研究也指出，在低溫的應激下，將ld4基因轉至煙草葉片的內部，能強化植物的抗寒抗凍性能［19］。盡管ld4在結構與功能上均可以實現限制冰晶的生長作用，然而對ld4在生物體中的信號傳導通路和其生物學的完整功能有關研究尚且沒有掌握。立足于生物學功能的相似性特征，將細胞應激顆粒的自身保護力作為研究出發點，有必要深入探究ld4等特異性的功能基因、細胞的保護機制和應激顆粒間的相互關系。

應激顆粒作為生物體面對惡變環境時的細胞所適應性形成的自我保護機制之一，其文獻研究主要集中于組分或抗氧化等的調控方面，而也有部分文獻總結出低溫應激也可促進細胞生成SG物質，然而沒有出現抗凍基因的功能與SG物質對生物體在低溫環境下影響力的文獻研究。國內研究體現出ld4基因的表達能明顯阻礙低溫下細胞中應激顆粒的合成，ld4基因的導入處理下提升了細胞應激顆粒的形成閾值，也即為ld4基因的導入下強化了生物體細胞的抗寒抗凍性能，使生物體細胞在低溫的應激下不容易生成應激顆粒，對于耐寒魚類的篩選育種方面具有較大的借鑒意義［20］。

低溫應激的環境下有ld4攜帶的斑馬魚存活率超出無ld4攜帶的斑馬魚，由此可鑒定出ld4在斑馬魚細胞中的存在可以顯著促進細胞的抗寒抗凍性能的提升［21］。對低溫處理過的細胞系以高通量測序的方式實施轉錄組的對比探究，分析ld4轉基因細胞系以及非轉化細胞在低溫刺激激發基因轉錄層面的不同之處，從而獲得ld4基因帶來的基因表達譜的變化情況，找到可能的信號傳導通路，并對其實施科學驗證。現初步排除了ld4是憑借凋亡途徑來對抗低溫應激的可能性，日后的研究有望通過ld4抗體對低溫影響下的和非低溫影響的ld4細胞系實施免疫共沉淀，運用蛋白質譜來測定與ld4互為作用的蛋白類型，且利用熒光共定位/酵母雙雜交等方法驗證和ld4互為作用的蛋白類型；在此前提下明確掌握限制低溫下細胞凋亡可能的信號傳導通路，研究其作用通路后益于運用到漁業養殖或其他的農作物品種育種篩選工作中。