細菌四類胞外感覺結構域的概述

許陽陽，袁文肅

（天津大學生命科學學院，天津 300072）

細菌在生長繁殖過程中需要適應外界環境的變化以及接受外界信息的輸入［1］。細菌通過多種信號傳導途徑適應外界環境的變化，最常見的有單組分系統、雙組分系統以及化學傳感系統［2］。其中，雙組分調節系統（Two-component regulating system，TCS）是細菌體內最重要的信號轉導系統，參與細菌大部分的生命活動，調節細菌適應外界的各種刺激反應，例如抗生素反應、滲透壓反應、群體信號、營養反應等。

已知幾大類跨膜TCS包括傳感器激酶、化學受體、趨光系統［3］。其中，最常見的雙組分轉導系統通常包括組氨酸激酶傳感器以及受體蛋白2個部分，組氨酸激酶傳感器存在于細胞膜或細胞質中，根據接收外界刺激的位置不同將細胞感覺結構域分為胞外感覺結構域、膜嵌入感覺結構域和胞質內感覺結構域。組氨酸激酶傳感器通過改變它們的磷酸化狀態直接響應物理或化學信號，受體蛋白上保守的天冬氨酸接受來自激酶的磷?；l生磷酸化，磷酸化的受體蛋白通過其C末端的效應結構域直接結合DNA引起細胞反應［4-8］。對大量細菌進行基因組測序后發現，部分細菌的雙組分信號轉導系統達200多個［9-11］。

化學感覺系統介導趨化性和基于第四型菌毛的運動性，其核心主要包括化學受體（也稱甲基趨化蛋白）、CHeA組氨酸激酶和CHeW偶聯蛋白形成的三元復合物。化學受體是位于信號通路輸入端的功能性信號蛋白，具有檢測高度特異性化學效應物，并將趨化信號傳導至下游蛋白的功能［12］。細菌中含有大量的化學受體，它們在拓撲結構、傳感模式、細胞位置以及配體結合結構域（Ligand binding domain，LBD）的類型上有所不同。組氨酸激酶傳感器和甲基接受趨化蛋白［13-15］（Methyl-accepting chemotaxis proteins，MCPs）在激酶和反應調節劑的磷酸轉移過程中涉及的保守的信號域有相似性。隨著科技的發展，基因組學的出現讓研究者了解到組氨酸激酶傳感器和MCPs之間的相似性。這2種傳感器蛋白共享胞內感覺結構域PAS（PER、ARNT、SIM）［16-19］、GAF（c-GMPspecific and-stimulated phosphodiesterases，Anabaena adenylate cyclases andEscherichia coliFhlA）［20，21］、HAMP（for histidine kinases，adenylyl cyclases，methyl-accepting proteins，and other prokaryotic signaling proteins）［22，23］，以 及 胞 外 感 覺 結 構 域Cache、4HB（four-helix bundle，4HB）、CHASE（cyclase/histidine kinase-associated sensory extracellular）、NIT（Nitrate-and nitrite-sensing）。

在雙組分系統和化學傳感系統中的信號結構域高度保守［24］，但其LBDs在一級序列和結構方面多樣［25］，因此胞外感覺域蛋白幾乎沒有同一性［26］。本研究根據胞外感覺域的結構特性主要介紹了Cache結構域、CHASE結構域、NIT結構域以及4HB結構域這4類胞外感覺結構域的結構特性以及結構與功能之間的關系。

1 Cache結構域

1.1 Cache結構域特征

Cache結構域是原核生物中最常見的1種胞外感覺結構域（圖1A），存在雙Cache結構域（dCache）和單一Cache結構域（sCache）2種形式，通常存在于雙組分組氨酸激酶和MCPs中。Cache結構域由1個長的N末端螺旋和1個或2個球狀模塊組成。Cache結構域最初作為細菌化學受體和動物鈣離子通道共有的配體結合域，同時也是抗神經病變藥物的靶點。Cache結構域能夠結合一些小的配體分子，比如：糖、有機酸和氨基酸等［27-29］。Cache家族中包含一些與PAS結構域相似的PDC結構域（PhoQ、DcuS、CitA），因此有研究者提出Cache結構域和PAS結構域具有同源性，并提出可能是PAS祖先早期作為胞外感覺域逐漸演化為現在的Cache結構域［30］。

PhoQ傳感結構域是類似于PAS的結構域，二價陽離子可以抑制PhoQ的活性，抗菌肽可以激活PhoQ的活性。一般PAS結構域有1個可以與小分子配體結合的凹槽，但PhoQ結構域沒有。PhoQ結構域是1個螺旋-轉角-螺旋（helix-turn-helix）的結構，這種結構特點形成了1個高負電荷的平面，帶負電荷的一面對著帶負電荷的磷脂雙層，一般需要鈣離子維持平衡。目前，已經提出的信號轉導機制是當鈣離子消耗盡的時候，2個帶負電荷的面互斥激活激酶，引起下游反應［31-33］。DcuS和CitA傳感器由胞外類PAS結構域（PDC）、2個跨膜螺旋、細胞質PAS結構域和激酶結構域組成。DcuS和CitA能夠結合不常見的C4—二羧酸鹽（左旋酒石酸鹽和右旋蘋果酸鹽）。

PDC結構域的主要特征是在其中心位置存在5個反平行的β-片層支架，兩側各有1個α-螺旋。PDC的β-片層結構與PAS的β-片層結構相同，其他部分的結構不同。雙PDC結構域的形成是由膜遠端的PDC結構域插在膜近端PDC結構域的第一個螺旋和第二個螺旋之間［34］（圖1B）。

圖1 Cache結構域在不同傳感器中的位置及Cache結構域的三維結構

單核細胞趨化蛋白-N是1個保守的N末端結構域，存在于幾種單核細胞趨化蛋白和含緩沖液的蛋白中。HAMP，發現于組氨酸激酶、腺苷酸環化酶、甲基結合蛋白和磷酸酶的1個結構域。樹突狀細胞結構域的主要特征是在其中心位置有4個反平行的β-折疊支架，每側有1個α-螺旋。DcuS感覺域的關鍵殘基是Arg107、His110和Arg147。

1.2 d Cache結構域的功能

dCache結構域是由2個串聯PAS樣亞結構域組成，分為膜近端結構域和膜遠端結構域，具有dCache LBD的化學受體對配體的喜好不同。根據已有的研究表明，具有dCache LBD的化學受體識別氨基酸、有機酸、多胺、半乳糖和組胺等［35］。

dCache結構域通過直接或間接的識別方式與小分子結合，通過直接識別的小分子通常與dCache的膜遠端亞結構域結合，也有部分與膜近端結構域結合；間接識別配體的方式通常是由底物結合蛋白介導的。

dCache型受體大部分通過膜遠端亞結構域與配體結合的方式識別配體，在識別不同氨基酸時以類似于結合異亮氨酸的方式結合到膜遠端亞結構域上。有研究表明，熒光假單胞菌CtaA LBD的配體結合口袋可以識別結構和理化性質上不同的氨基酸，配體結合口袋可以根據配體側鏈的大小膨脹或收縮［36］。CtaA LBD的蛋白質側鏈（R126、W128、Y144、D146、D173）能夠識別配體氨基酸上不變的氨基和羧基部分。這5個殘基在dCache型化學受體中是保守的，能特異性識別氨基酸?？漳c彎曲桿菌CjTlp3 LBD與異亮氨酸相互作用時，配體完全被末端磷腺苷酸結構域吞噬，在蛋白質與配體的側鏈和主鏈部分之間形成廣泛的相互作用。對CjTlp3 LBD中與CtaA LBD對應的5個保守殘基進行丙氨酸取代（圖2A），通過等溫滴定量熱法（Isothermal titration calorimetry，ITC）試驗驗證突變后的CjTlp3 LBD顯著降低了異亮氨酸結合的親和力［37］。同樣，對銅綠假單胞菌PctA LBD中與CtaA LBD對應的5個保守殘基進行丙氨酸取代，通過ITC試驗驗證PctA LBD突變后顯著減少或消除了其與氨基酸的相互作用［38］。這些突變研究為這5個保守殘基在識別氨基酸中具有重要作用提供了證據。識別組胺的dCache型受體具有結構相似性。在TlpQ受體中識別組胺的4個關鍵 殘基E170、Y208、D210和D239（圖2B），除D210外，其他3個殘基同樣存在于McpA受體中，這些殘基形成與TlpQ相似的配體口袋。在McpA受體中D210被Y174取代在組胺的咪唑環中引起空間位阻［39］。

現有文獻中，僅有少量結果證明配體與dCache結構域膜近端亞結構域的結合［40］。幽門螺桿菌TlpC LBD結合乳酸鹽是證明dCache結構域通過膜近端結合配體的第一個例子，乳酸與TlpC的配體口袋（由 殘 基F202、L210、N213、I218、L223、Y249、L252、S253和Y285）結合（圖2C），乳酸鹽的羧基和羥基，N213、Y249和Y285的側鏈以及L252和S253的主鏈酰胺形成氫鍵，將N213、I218、Y285突變為丙氨酸，Y249突變為苯丙氨酸，通過圓二色譜試驗顯示氨基酸的突變沒有引起二級結構的改變，并且ITC試驗表明這些氨基酸突變后與乳酸鹽的結合能力消失［40］。銅綠假單胞菌McpP受體的sCache結構域以相似的親和力結合乳酸鹽。

圖2 化學受體傳感器的d Cache結構域

1.3 sCache結構域的功能

化學受體中含有大量的dCache結構域和sCache結構域，雖然這2種結構域都可以結合有機酸，但是它們的配體分布不同。丁香假單胞菌的化學受體PscD含有sCache結構域，能夠識別特定的C2和C3羧酸配體。丙酸酯通過羧基氧原子與sCache結構域的4個殘基（Y90、H103、Y143和K156）以氫鍵的方式與受體結合。通過對一系列sCache結構域序列進行比對，Y90、H103和K156 3個殘基是高度保守的［41］。KT2440細菌的化學受體McpP含有sCache結構域，可以結合乙酸鹽、丙酮酸鹽和丙酸鹽，McpP基因的缺失導致這些配體的趨化性顯著降低［42］。銅綠假單胞菌受體PA2652的sCache結構域能夠結合幾種C2取代的C4-二羧酸，并且通過ITC試驗表明PA2652只結合蘋果酸、檸檬酸、甲基琥珀酸的左旋異構體，而不結合右旋異構體［43］。

目前只鑒定了少數的Cache結構域，其中大多數對單羧酸具有高度特異性。雖然Cache結構域與PAS結構域同源，但Cache結構域的功能多樣性沒有得到充分研究。觀察以上幾種蛋白dCache中的關鍵殘基的組成可以發現，這些關鍵殘基集中分布在β-片層區域并且大多為極性氨基酸，因此猜測這些極性氨基酸的側鏈可能在結合配體中發揮重要作用。dCache結構域通過幾種不同的直接或間接的機制結合配體，這些配體結合dCache結構域的膜末端結構域或膜近端結構域或者二者兼有，由于這種多樣性，導致對不同的dCache結構域是否共享同一種跨膜信號轉導機制仍不清楚。因此，還需對不同dCache結構域的結構與功能進行研究與分析。

2 CHASE結構域

2.1 CHASE結構域的結構特性

CHASE結構域是由200～230個氨基酸殘基組成的胞外LBD，存在于細菌、低等真核生物和植物的傳感器蛋白的N端或細胞外區域。在CHASE結構域之后會連接PAS、GAF或受體結構域等非酶結構域，以及組氨酸激酶、腺苷酸環化酶、GGDEF和EAL結構域［44］等酶信號結構域。根據數據分析，CHASE的結構與PAS、GAE以及Cache結構域具有相似性，并且CHASE的結構總是在2個跨膜區之間。目前，已經鑒定了從CHASE2到CHASE8 7種CHASE結構域。

CHASE2結構域存在于多種細菌信號傳導途徑的傳感蛋白中，如組氨酸激酶、腺苷酸環化酶、二苷酸環化酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶。通過SMART分析CHASE2結構域（以Spirulinasubsalsa PCC 9445為例）可能連接非酶結構域以及酶信號結構域（圖3A）［45］。CHASE3結構域（Spirulina platensis）一般存在于組氨酸激酶、甲基接受趨化蛋白、腺苷酸環化酶和二胍酸環化酶中，通常與PAS、HAMP和GAF這些非酶結構域相結合（圖3B）。CHASE4結構域只存在于信號轉導蛋白中，如傳感器組氨酸激酶和二鳥苷酸環化酶/磷酸二酯酶（Archaeoglobus fulgidis）（圖3C），部分CHASE4的蛋白質含有HAMP［46］和PAS結構域。

根據預測CHASE4結構域可以結合多種低分子配體，如細胞分裂素樣腺嘌呤衍生物或肽，并通過各自的受體介導信號轉導。另外，CHASE5、CHASE6、CHASE7以及CHASE8都存在于組氨酸激酶中，到目前還沒有對CHASE4結構域的完整解析，因此利用Robetta server對CHASE4進行結構預測（圖3D），從而可以根據預測的結構特征對CHASE4的功能進行合理預測。

圖3 CHASE結構域在不同傳感器中的位置及對CHASE4的結構預測

2.2 CHASE結構域的功能

CHASE結構域可以識別環境中的許多信號，例如有機酸、氨基酸和根分泌物中的其他化學化合物［47，48］。植 物 傳 感 器AHK4的CHASE結 構 域 是AHK4識別各種化學上不同細胞分裂素的重要結構域，AHK4的配體結合口袋具有疏水殘基和極性殘基，已發現它們分別接觸脂肪族或芳香族尾基和極性腺嘌呤基團［49］。目前在AHK4結構方面的研究有一些進展，但是AHK4識別細胞分裂素的分子機制還不清楚［50］。植物病原體黃單胞菌PcrK的CHASE結構域（圖4A）與AHK4的結構（圖4B）相似，結合細胞分裂素，以二聚體形式存在。PcrK的CHASE結構域由2個PAS樣結構域組成，與AHK4的不同在于PcrK的配體結合口袋大小受細胞分裂素限制。PcrK的配體結合口袋具有高度的疏水性，在14個氨基 酸（I114、P164、L167、V69、R175、T191、V194、L196、S197、Y199、L208、L210、W233和Y235）中有9個是疏水的，其余5個是極性或帶電荷的氨基酸［51］。PcrK二聚體結合來自植物的異戊烯基腺嘌呤（iP），L196突變導致PcrK的CHASE結構域無法結合配體，Y191突變破壞識別配體所需構象。同時通過ITC試驗證明單獨的PcrK無法與iP結合，可能需要1個尚未鑒定的分子幫助PcrK與iP結合［51］。

圖4 Pcr K和AHK 4的三維結構

目前的研究表明［26］，CHASE結構域一般以二聚體的形式存在，但研究者發現CHASE結構域單體和二聚體同時存在，單體如何轉變成二聚體，是否與配體結合有關，尚不清楚。

3 NIT結構域

3.1 NIT的結構特性

NIT（Nitrate-and nitrite-sensing）結構域是特異性識別硝酸鹽或亞硝酸鹽的1種結構域。許多細菌都是通過將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽進一步還原成銨來吸收硝酸鹽，也有一部分細菌將硝酸鹽當成無氧呼吸時最終的氧化劑，因此NIT結構域在細菌利用硝酸鹽的過程中發揮重要作用，同時還可以控制包括基因表達的調節、細胞運動性以及酶活性等多種生物活性。

NIT結構域是在NasR蛋白中發現的，其長度約為200個氨基酸殘基。在許多的細菌中都能發現NIT結構域，它與許多的調節輸出結構域相關，比如，ANTAR（AmiR和NasR轉錄抗終止調節因子）、組氨酸激酶、甲基受體趨化蛋白、GGDEF和EAL等（圖5A）。NIT結構域（圖5B）不同于其他的感覺域，例如PAS和GAF是單純的胞內感覺結構域，CHASE和Cache是單純的胞外感覺結構域，但是NIT既可以作為胞內感覺結構域也可以作為胞外感覺結構域［52］。

圖5 NIT結構域在不同傳感器中的位置及NIT結構域的三維結構

3.2 NIT結構域的功能

NasR蛋白是1種RNA結合蛋白，包含1個大的N端NIT結構域和C端的RNA結合ANTAR結構域，NIT結構域將硝酸鹽和亞硝酸鹽的感知與多種轉錄和行為反應相結合。之前已對硝酸鹽和亞硝酸鹽結合蛋白NarX進行研究，NarX輸入域是1個四螺旋束的二聚體，通過每個單體中保守的Arg殘基的氫鍵部分結合硝酸鹽。NasR蛋白的NIT結構域與NarX輸入域的結構和功能具有高的相似性。二聚的NIT結構域的每個單體包含1個四螺旋束，在單體中的1對Arg殘基幾乎與NarX中的Arg殘基完全對應［53］。NasR蛋白通過NIT結構域接受硝酸鹽信號，ANTAR結構域結合到RNA上激活nasF操縱子，引起硝酸鹽的同化作用。ANTAR的一些殘基與NIT結構域中的殘基（Q204-N373、D201-R366、R193-E359、E191-R340和Q194-W362）通過形成氨基酸配對相互作用，形成自動抑制機制。通過突變破壞這些相互作用，可以將NIT結構域與ANTAR結構域分離［54］，由此可以猜測極性氨基酸在結合配體中發揮重要作用。

目前在很多信號轉導途徑并且能夠調節細胞功能的受體中檢測到NIT結構域，在2個螺旋束的界面上關鍵的谷氨酰胺和精氨酸都是保守的，這是否意味著NIT結構域在這些受體蛋白中同樣發揮識別硝酸鹽的功能或者具有識別其他配體的功能，還需進一步研究。

4 四螺旋束結構域

4.1 四螺旋束的結構特性

在組氨酸激酶傳感器的胞質外發現的另一類常見的全α-螺旋感覺結構域也被稱為四螺旋束結構域（four-helix bundle 4HB）［55，56］。在第二個跨膜螺旋上并位于細胞質末端的1個或多個芳香殘基可能參與脂質-水界面相互作用，并調節跨膜信號［11］。含有4HB結構域的化學受體一般是同型二聚體，它們有1個很大的周質結構域，由2個相同的反平行的四螺旋束組成。受體的跨膜區是由每個亞單位的2個跨膜α螺旋配對形成的單個反平行四螺旋束［57］。

在組氨酸激酶傳感器、MCPs、二鳥苷酸環化酶以及腺苷酸環化酶中都存在4HB結構域。4HB位于2個跨膜螺旋之間，表明4HB結構域只檢測細胞外的信號。最初是通過對細菌趨化性天冬氨酸受體的半胱氨酸和二硫鍵研究發現，4HB結構與HAMP結構域有非常密切的聯系，同二聚體HAMP的每個亞單位都有1個螺旋-連接體-螺旋結構，該特點也成為HAMP結構域的標志［58］。位于膜遠端的4HB所感受到的外界信號，通過膜近端的平行4HB傳遞跨膜，然后與HAMP結構域偶聯。現有的推測認為，信號傳輸是通過跨膜螺旋2相對于跨膜螺旋1的類似活塞的垂直位移發生的，信號傳遞的過程基本可分為3步：①膜遠端的4HB作為胞外感覺域結合配體；②將信號通過膜近端螺旋傳遞給胞質HAMP結構域；③再通過HAMP將信號轉換成界面信號傳遞給組氨酸激酶、腺苷酸環化酶等，將信號傳遞到下游作出相應反應［59，60］。

4.2 四螺旋束結構域的功能

4HB結構域是在原核生物中分布最廣泛的感覺結構域，Tar和Tsr是研究4HB結構域的主要模型，它們的4HB結構域能夠識別天冬氨酸和絲氨酸［61，62］。在Tar和Tsr的二聚體界面上有2個配體結合位點，它們具有負協同性［63］，配體與其產生相互作用，穩定二聚體的狀態。通過X射線衍射解析了Tar與配體復合物的結構，發現結合結構域中與天冬氨酸相互作用的關鍵殘基，在Tar-LBD的2個單體界面上各有1個天冬氨酸結合位點，其中1個結合位點 的 殘 基 由B鏈 的 殘 基R64、S68、Y149、F150、Q152、T154和Q155以及來自A鏈的殘基R69和R73形成，而在另1個位點處只發現了與水分子的結合［64］。在Tsr-LBD中的R64和T156的突變明顯地影響受體對絲氨酸的感知［65］，Tar或Tsr中R64的突變大大降低或消除了配體結合和趨化性。最近有研究發現新的具有4HB結構域的化學受體PcaY_PP，PcaY_PP-LBD二聚體的2個配體結合位點全部結合高親和力的原兒茶酸鹽和奎寧酸鹽，低親和力的配體苯甲酸鹽和水楊酸鹽只能結合1個位點。PcaY_PP的LBD分別與大腸桿菌Tar和Tsr的LBD僅具有16%和10%的蛋白質序列同一性。在PcaY_PP-LBD中的R71識別配體的羧基，同時配體口袋中有大量極性不帶電荷的殘基，即N75、S73、S78、Y135、Q142、N158和Q169（圖6），它們與結合的配體建立了許多氫鍵。R71的丙氨酸取代導致所有配體無法結合，N75的丙氨酸取代導致PcaY_PPLBD無法與原兒茶酸鹽和奎寧酸鹽結合，同時對其他配體的親和力降低［66］。根據對Tar和Tsr的LBD以及PcaY_PP LBD的配體口袋氨基酸的分析發現大部分的氨基酸由極性氨基酸組成，極性氨基酸的突變直接影響與配體的結合，猜測極性氨基酸在4HB結合口袋里發揮重要的作用。

圖6 PcaY_PP（PDB：6S1A）的三維結構

盡管4HB是細菌信號轉導系統中分布最廣泛的細胞外感覺域，但是對4HB的所有了解幾乎都來自對Tar和Tsr的研究，那么具有4HB的其他受體中對應Tar的R71是否同樣是結合配體的關鍵殘基，是否以相同的傳導機制發揮與Tar和Tsr相似的功能，還需要深入研究。

5 小結與展望

雙組分調節系統和化學傳感系統是細菌感知外界系統的重要組成部分，二者共享Cache結構域、CHASE結構域、NIT結構域以及四螺旋束結構域4種感覺結構域。對Cache結構域、CHASE結構域、NIT結構域以及四螺旋束結構域4種感覺結構域進行分析發現，Cache結構域和CHASE結構域的序列同源性最高。在CHASE結構域中存在類似Cache結構域的2個PAS樣結構，根據這些相似性猜測Cache結構域和CHASE結構域可能具有相同的信號轉導機制。目前發表的文獻中CHASE結構域多以二聚體形式結合小分子［25，26］，而天津大學生命科學學院結構生物學實驗室通過對CHASE4結構域的研究，發現與已經發表的CHASE結構域不完全一致，其研究的CHASE4結構域存在單體和二聚體2種狀態，并針對這種現象提出了2點猜測：一是CHASE4結構域是在單體和二聚體共存的狀態下發揮作用，二是CHASE4結構域在原核系統表達時受某種因素影響從部分二聚體體裂解成單體。針對以上2種猜測還需后續從功能以及結構方向的研究進行驗證。NIT結構域和四螺旋束結構域都是由螺旋構成，二者具有很高的相似性，這是否意味著二者會有相同的傳感機制仍需要深入研究。Cache結構域、CHASE結構域、NIT結構域以及四螺旋束結構域4種感覺結構域結合配體的關鍵殘基大多為極性氨基酸或疏水氨基酸并且在各感覺域中是高度保守的，猜測這些關鍵殘基的特性可能影響配體的種類。

本研究雖然對Cache結構域、CHASE結構域、NIT結構域以及四螺旋束結構域這4種感覺結構域有一定的認識，但仍然存在一些問題沒有解決。對于Cache結構域、CHASE結構域、NIT結構域的功能多樣化沒有進行深入的研究。目前，已經了解雙組分傳感器和化學傳感器的工作模式，但對感覺結構域捕捉到信號后的結構變化以及整個受體蛋白是如何通過結構變化將信號進行傳遞有待研究，未來基因組學的研究將會揭示更多信號與信號之間的關系，并進一步加深研究者對信號轉導的理解。