人參根腐病離體抗性篩選方法初探

張晶晶，張 寧，侯 微，曲正義，李亞麗，鄭培和

（中國農業科學院特產研究所，長春 130112）

人參（Panax ginsengC.A.Meyer）是五加科人參屬多年生草本植物，具有很高的藥用價值和經濟價值［1］。早在西漢時期，人參就在治療和防御疾病等方面被廣泛應用［2］。人參藥用部位為多年生宿根，生長周期長，易遭受多種病原菌的侵染［3］。人參根腐病是一種土傳性真菌病害，是人參根部主要病害之一［4］。該病發病初期癥狀不明顯，后期葉片開始變黃，地下根部腐爛，嚴重時可導致整株人參死亡，對人參的產量和質量造成很大的影響［5-7］。篩選并培育人參抗根腐病品系是有效且常用的防治病害的方法之一，而抗病品系的發掘和利用是培育抗病品種的重要環節，因此，建立一套準確、實用的人工接種抗病性篩選方法，可以加快人參的抗病育種進程。

鄧麗君等［8］研究表明離體葉片接種法可用于甜瓜白粉病生理小種的鑒別和抗源鑒定。朱麗梅等［9］采用自然病圃法和離體葉片接種法分別對茄子早疫病進行抗病性篩選比較，鑒定結果基本一致，說明離體葉片接種法可作為茄子早疫病抗病性篩選的輔助手段。與活體接種篩選相比，離體葉片接種法篩選具有不損傷植株、節省菌液、接種標準一致以及不易產生病原菌擴散等優點［10］，但根腐病離體抗性篩選相關的報道相對較少。有研究表明，在木薯和白掌中可通過離體葉片接種法對根莖部病害進行抗性篩選［11，12］。在百合中，離體葉片接種法可用于鱗莖腐爛病抗性資源篩選，并通過試驗表明該方法可靠、有效［13］。

目前，國內外鮮見人參根腐病離體抗性篩選的相關報道。本研究通過人參離體接種方法對人參離體葉片和根塊進行根腐病接種，并利用病斑直徑及發病情況對人參種質材料進行抗病性評價，為人參根腐病的抗性篩選及資源評價提供新的技術參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為吉林省吉林市左家鎮試驗基地（中國農業科學院特產研究所左家資源圃）4年生人參。

1.2 供試菌株

腐皮鐮刀菌（Fusarium solani），由中國農業科學院特產研究所分子生物學實驗室前期篩選所得。

1.2.1 培養基 固體培養基：稱取37 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），加入1 000 mL去離子水中，加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌15 min，備用。

液體培養基：稱取35 g馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基（PDB），加熱攪拌，溶于1 000 mL去離子水中，分裝，115℃，高壓滅菌20 min，備用。

1.2.2 菌種培養 活化培養：將帶有腐皮鐮刀菌菌絲的瓊脂塊通過無菌手術刀切成0.4～0.5 cm的菌塊，接種到PDA培養基的平板上。封口膜封口后，倒置于25℃培養箱中，活化培養2～3 d，至白色菌絲長滿培養基表面時取出。

擴大培養：將活化培養的0.4～0.5 cm的菌塊，接種到新的PDA培養基，相同條件下培養2～3 d，至白色菌絲長滿培養基表面時取出，備用。

將保存的根腐病菌轉接到PDB液體培養基中，將其在溫度為25℃、轉速為200 r/min的搖床上避光搖3 d，使其產生大量的孢子，將含孢子的PDB液體培養基用2層無菌紗布過濾，除去菌絲以獲取孢子懸浮液，利用血球計數板在顯微鏡下將孢子懸浮液的濃度調整為1×106個/mL，用于接種鑒定。

1.2.3 人參離體葉片接種 每株摘取6片完全展開的葉片，采用菌塊、孢子懸浮液2種不同的接種方法分別對人參葉片正反面進行接種，每組3次重復，以不接種病菌作為對照，將葉片置于含有吸水濾紙的培養皿中，使用10μL的移液器吸取10μL的孢子懸浮液滴在單葉的葉脈2側，用打孔器打取菌塊（直徑4 mm）在同樣位置接種于單葉的葉脈2側，培養皿補充少量清水，封口后置于生化培養箱中，每天14 h光照、10 h黑暗處理。每天觀察葉片的發病情況，并測量病斑直徑大小。

1.2.4 人參根塊接種 取人參（與前面離體葉片所用的人參來自同一品系）根塊置于空培養皿中，在每塊人參根塊上接種病原菌孢子懸浮液10μL，以沒作任何處理的根塊作為對照組，將培養皿放于25℃的培養箱中黑暗培養，觀察人參根塊的發病情況。

1.2.5 不同品系人參抗性評價 每個品系（編號：FS、SW、HS、FX2）摘取完全展開的葉片，采用菌塊接種方法對人參葉片進行正面接菌，4組重復，以不接種病菌作為對照，將葉片置于含有吸水濾紙的培養皿中，培養測量方法同“1.2.3”。同時，采取4種不同品系人參的參須進行平行抗病性評價。

1.2.6 病害嚴重度分級 病害嚴重度分級標準：1為無明顯損傷；2為病斑直徑小于1.0 cm；3為病斑直徑為1.0～1.5 cm；4為病斑直徑為1.5～2.0 cm；5為病斑直徑大于2.0 cm，病斑相連呈不規則大斑塊；6為整片葉片侵染發病。計算病情指數。其中病情指數分為4級：1級，免疫，病情指數=0；2級，高抗（HR）0＜病情指數≤35.0；3級，中抗（MR），35.0＜病情指數≤50.0；4級，高感（HS），病情指數＞50.0。病情指數計算公式如下。

1.2.7 人參抗、感株系的參須回接試驗 通過離體葉片方法從1 424株人參中篩選出人參抗病株50株，從中選取8株抗病株和8株感病株，取其參須進行回接試驗，在每組抗感株系的參須上各接種病原菌孢子懸浮液10μL，于25℃的培養箱中黑暗培養，3 d后觀察參須的發病情況。

1.3 數據分析

統計分析采用Prism 6軟件對離體葉片接種法進行相關分析。

2 結果與分析

2.1 人參離體葉片接種法分析

以相同濃度的菌懸液（1×106個/mL）分別采用正面和反面2種接種方法接種到人參同一植株不同葉片上，試驗設置3組重復。對接種5 d后的葉片進行調查（圖1），發現2種方法均可誘導葉片發病，對照組不發病，且葉片正面接菌比背面接菌發病更快，病斑更大。正面接種產生的病斑直徑大小平均為2.01 cm，反面接種產生病斑大小的平均值為1.82cm。采用同樣大小菌塊（直徑0.40 cm）進行接種（圖1），結果表明，正面和反面2種接種方法均可誘導葉片發病，對照組不發病。正面接種產生的病斑直徑大小平均為2.17 cm，反面接種產生的病斑直徑大小平均為2.03 cm。比較正、反面2種接種方法的效果，正面接種要比反面更容易受到病原菌的侵染，對比菌液和菌塊接種，菌塊接種比菌液接種能產生更大的病斑，說明菌塊接種發病效果更好。

圖1 人參根腐病不同接種方法比較

2.2 人參離體葉片發病癥狀表現

利用離體葉片接種法接種，人參離體葉片發病癥狀表現如圖2所示。從圖2可以看出，接種3 d后，接種部位出現病斑；接種5 d后，病斑明顯擴大且葉片開始發黃；接種7 d后，接種部位腐爛，葉片整體發黃，病斑幾乎蔓延整個葉片；接種11 d后，整個葉片失綠且腐爛。因此可以確定接種5 d后對發病情況進行調查最為合適。

圖2 人參離體葉片接種不同時間發病癥狀對比

2.3 人參根塊接種法分析

將腐皮鐮刀菌接種于人參根塊上，回接驗證效果見圖3。從圖3可以看出，接種3 d后，人參根塊上面長有明顯的病斑，病原菌生長旺盛，菌絲體向外延伸，根塊有腐爛跡象。接種5 d后，根塊開始泛黃，出現腐爛現象。接種7 d后，根塊松軟，且腐爛部位顏色加深，整個根塊幾乎全部腐爛。人參根塊接種結果與離體葉片接種結果基本一致。

圖3 人參根塊回接驗證

2.4 不同品系人參離體葉片接種抗性評價

接種5 d后，對葉片發病情況進行調查，調查結果見表1。FS發病情況最輕，病斑直徑最小，HS發病情況最嚴重，病斑直徑最大，SW和FX2發病情況差不多，SW病斑直徑比HS略微小一些。通過統計病斑直徑可知，4個品系中，FS抗病性最強，HS抗病性最差；通過計算其病情指數可知，FS為高抗等級，SW為中抗等級，HS和FX2為高感等級。

表1 不同品系人參葉片抗病性鑒定

2.5 不同品系人參須接種抗性評價

采取4種不同品系人參的參須進行抗病性評價（圖4）。接種3 d后，對參須發病情況進行調查，發現FS參須腐爛情況最輕，SW和HS居中，FX2發病情況最嚴重，說明FS抗病性最強，FX2抗病性最差，該結果與離體葉片抗性評價基本一致。

圖4 不同品系人參須抗病性鑒定

2.6 人參抗、感株系的參須回接試驗

取抗病株和感病株的參須，將腐皮鐮刀菌懸液分別接種于參須上，回接驗證結果見圖5。結果發現接種3 d后，抗病株有輕微發病現象，參須腐爛情況不明顯，感病株整體腐爛嚴重。通過參須回接試驗進一步表明離體葉片接種法可用于人參根腐病的抗性篩選。

圖5 人參須回接驗證

3 小結與討論

目前在三七中，已經采用離體葉片接種法建立了一種用于三七黑斑病抗性鑒定的方法［14］。在大豆中也有相關研究，可采用離體葉片接種的方法對大豆疫霉根腐病抗病性進行鑒定［15］。在水稻中，采用q-PCR和離體葉片相結合的方法對水稻紋枯病發病程度進行定量分析［16］。任琴琴等［17］通過分子標記與離體葉片接種方法相結合，對甜瓜蔓枯病抗感材料進行了篩選，成功篩選出了抗感株系。在西瓜中，建立了一種西瓜炭疽病菌離體葉片接種鑒定技術，可用于對炭疽病抗性進行鑒定［10］。張志剛等［18］通過分析小麥白粉病在室內植株上的發病特點，進行了離體葉片人工接種方法的探索，結果表明該方法可行。應用離體葉片法還可以對菠蘿資源心腐病抗性進行鑒定［19］。研究表明［11］，離體葉片接種法可用于篩選木薯根腐病抗病資源，是一種高效、可靠的抗性篩選方法，為木薯抗病育種奠定了基礎。林善海等［20］發明了一種采用離體葉片鑒定甘蔗梢腐病抗性的方法，該方法無需按照季節進行甘蔗種苗的種植，不受甘蔗苗齡和場地的限制，操作簡便、重復性好，對大量樣本的篩選具有較好的省工、省時的特點。戴樺均［12］通過研究明確了離體葉片接種法可用于植物根部病害抗性篩選的可行性，克服了傳統根莖部病害抗性鑒定的不足。

本研究嘗試將離體接種法應用于篩選人參根腐病抗病性的可能性，將人參根腐病接種到離體葉片上，并采用菌塊、菌液2種不同接種方法分別對人參葉片正、反面進行接種，結果表明，正面接種要比反面接種更容易受到病原菌的侵染，菌塊、菌液接種相比較，菌塊接種發病效果更好。將病原菌接種到人參根塊上，發現發病情況和葉片基本一致，通過2種離體接種方法比較，表明用離體葉片比用根塊接種更加直觀、簡便，進一步通過人參抗感株系的參須回接試驗，初步證明離體葉片接種法可以用于人參根腐病的抗性篩選。通過對不同品系人參進行接菌試驗，發現FS抗病性最好，FX2抗病能力最差，通過統計病斑直徑，計算其病情指數可知，FS為高抗等級，SW為中抗等級，HS和FX2為高感等級，試驗表明離體葉片接種法可用于人參根腐病抗性篩選。本研究對人參根腐病離體抗性篩選方法進行了初步探究，發現該方法可用于對試驗田的人參進行抗感株系的初步篩選，具有操作簡便、植株發病癥狀明顯、速度快、不傷害植物等優點，為人參根腐病抗性篩選提供更多輔助方法，為人參抗根腐病種質資源的篩選提供參考。